白細胞介素2和白細胞介素6對肝癌細胞表達血管內皮生長因子B的調節

田貴金，唐瑞峰，孫 超，苑建磊，齊 帥，李智峰

(1.河北醫科大學第四醫院肝膽外科，河北 石家莊 050011；2.河北省邯鄲市第一醫院普外三科，河北 邯鄲 056002)

原發性肝癌惡性度高，預后差是因為腫瘤具有強大的生長和轉移能力，而癌細胞的浸潤和遠處轉移與血管內皮生長因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)密切相關。其通過誘導腫瘤周圍血管新生，促進癌細胞血行轉移。VEGF-B的表達受多種細胞因子的調節，其中細胞因子白細胞介素(interleukin，IL)2、6可以通過影響細胞活動力、腫瘤細胞的增殖、腫瘤特異性抗原的表達從而影響腫瘤的進展，也可以通過調節VEGF-B的表達來影響腫瘤的生物學特性。本研究分析IL-2及IL-6對人肝癌細胞表達VEGF- B的調節，旨在為肝癌的治療提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 細胞培養、刺激及總RNA的提取：在37℃、5%CO2的飽和濕度的無菌培養箱中應用RPMI 1640培養基(含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)培養人肝癌細胞株SMMC-7721及BEL-7402。細胞呈穩定對數生長后，更換濃度為0.1%胎牛血清RPMI 1640培養基繼續培養12h，以消除血清對細胞增殖的影響。然后分別應用含有0.1、1、10、100、200μg/L的IL-2或IL-6的0.1%胎牛血清的培養基作為實驗組，分別培養3、6、12、24h，對照組中加入等劑量的磷酸鈉鹽緩沖液培養，定時收取細胞后以Trizol一步法提取刺激前后總RNA。

1.2 RT-PCR：取總RNA 2μL，加入AMV逆轉錄酶及逆轉錄反應物，42℃、反應60min；取所得單鏈cDNA 2μL，加入VEGF-B正義引物2.5μ、反義引物2.5μL、PCR反應物13μL，使總反應體系為20μL，94℃、3min預變性，95℃、45s變性，57℃、45s退火，72℃、1min延伸，共擴增35個循環后72℃、5min再次延伸。同法，取所得cDNA 2μL，加入GAPDH正義引物2.5μL、反義引物2.5μL、PCR反應物13μL，使總反應體系為20μL，預變性條件95℃、3min，變性條件94℃、30s，57℃、30s退火，72℃、 30s延伸，共擴增35個循環后72℃再次延伸5min。擴增循環數由PCR擴增動力學實驗決定。各PCR總產物在普通瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳，運用溴化乙啶染色，所得DNA電泳條帶和光量子強度以凝膠掃描儀進行檢測分析，以GAPDH作為內參照，并將VEGF-B/GAPDH比值作為相對定量值對VEGF-B產物相對定量。VEGF-B正義引物，5′TGTCCCTGGAAGAACACAGCC3′，反義引物，5′GCCATGTGTCACCTTCGCA 3′，它對應生成1個336個堿基的基因片段。GAPDH正義引物，5′GGGAAACTGTGGCGTGAT3′，反義引物，5′GTGGTCGTTGAGGGCAAT3′，它對應生成1個342個堿基的基因片段。

2 結 果

在0.1～200μg/L范圍內，隨濃度的增加，IL-2抑制肝癌細胞株SMMC-7721 VEGF-B mRNA表達的作用逐步增強，但與作用時間無明顯關系(圖1)。

圖1 IL-2對肝癌細胞SMMC-7721表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 1 Expression of VEGF-B mRNA in SMMC-7721 cell line stimulated by IL-2

隨濃度的增加，IL-2抑制肝癌細胞株BEL-7402 VEGF-B mRNA表達的作用逐步增強，3h 0.1μg/L與1μg/L實驗組之間VEGF-B mRNA的表達差異無統計學意義(P=0.488)，12h 0.1μg/L與1μg/L實驗組之間VEGF-B mRNA的表達差異無統計學意義(P=0.074)；但與作用時間無明顯關系(圖2)。

圖2 IL-2對肝癌細胞BEL-7402表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 2 Expression of VEGF-B mRNA in BEL-7402 cell line stimulated by IL-2

隨濃度的增加，IL-6促進肝癌細胞株SMMC-7721 VEGF-B mRNA表達的作用逐漸減弱，但與作用時間無明顯關系(圖3)。

圖3 IL-6對肝癌細胞SMMC-7721表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 3 Expression of VEGF-B mRNA in SMMC-7721 cell line stimulated by IL-6

IL-6對肝癌細胞株BEL-7402 表達VEGF-B mRNA無明顯影響(圖4)。

圖4 IL-6對肝癌細胞BEL-7402表達VEGF-B mRNA的影響

Figure 4 Expression of VEGF-B mRNA in BEL-7402 cell line stimulated by IL-6

3 討 論

原發性肝癌(簡稱肝癌)是我國病死率很高的惡性腫瘤，早期診斷率低，病情進展快，預后差[1]。早期血行轉移是導致肝癌預后差的主要原因之一，而腫瘤的生長和轉移有賴于血管新生，血管內皮生長因子家族(vascular endothelial growth factor family,VEGFs)是促進血管新生的關鍵因子之一，VEGFs包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(placenta growth factor，PIGF)，我們的前期研究顯示VEGF-B及其受體Flt-1在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁肝組織和正常肝組織，且二者在肝癌中的表達呈顯著正相關，二者相互作用促進肝癌血管生成，進而促進肝癌的浸潤和轉移[2]。

在惡性腫瘤的進展中某些細胞因子起重要作用[3-4]。這些細胞因子是癌細胞與基質細胞間相互作用的主要介質，而癌細胞與基質細胞間相互作用是癌細胞浸潤周圍組織、形成淋巴和遠處臟器轉移的關鍵。IL-1和IL-6可促進VEGF的表達，促進新生血管的形成[5]；IL-1α和IL-6可刺激胰腺癌細胞產生VEGF-A和VEGF-C，是胰腺癌細胞合成和分泌VEGF-A、VEGF-C的調節因子[6]；IL-2通過抑制胰腺癌細胞產生VEGF-D而抑制胰腺癌淋巴轉移[7]；Salven等[8]報道了IL-1α通過誘導炎癥細胞合成和分泌VEGF-A促進血管新生；Huang等[9]證實了IL-6刺激胃癌VEGF-A的產生并使癌組織中新生血管增加。

IL-2是一種重要細胞因子，IL-2不僅能通過激活免疫系統殺傷腫瘤細胞，同時能抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[10-11]。本研究表明，IL-2對2種肝癌細胞株SMMC-7721及BEL-7402產生VEGF-B mRNA均有抑制作用。提示IL-2通過抑制肝癌細胞產生VEGF-B而抑制肝癌的血行轉移。

IL-6在免疫應答及炎癥反應中起重要作用，它可以通過細胞因子網絡影響宿主環境進而作用于腫瘤細胞，對腫瘤細胞有抑制和促進的雙重作用。多種疾病可能都與IL-6基因調節異常有關[12]。當IL-6及其受體平衡失調時，會影響機體內環境的穩定，進而導致免疫功能紊亂，誘導腫瘤的發生發展。本研究顯示IL-6刺激肝癌細胞株SMMC-7721產生VEGF- B明顯增加，從而可能使肝癌細胞更易發生血行轉移，是肝癌難以早期發現和預后較差的原因之一。肝炎后肝硬化基礎上發生的肝癌，癌細胞周圍的微環境中因炎性反應致IL-6呈持續高水平表達，刺激癌細胞產生VEGF-B增加，使癌細胞更易發生肝內等血行轉移，這可能是肝炎后肝硬化基礎上發生的肝癌其預后較無肝炎肝硬化背景的肝癌的預后差的原因之一，也可能是臨床上抗病毒加抗癌“雙管齊下”較單純抗癌治療效果更好的原因之一。但IL-6對肝癌細胞的作用可能是一把“雙刃劍”，其作用隨劑量、機體微環境的變化而不同，仍需進一步研究。

[1] 陳孝平,陳漢，沈峰，等.肝膽外科學 [M].北京：人民衛生出版社，2005：449-451.

[2] 唐瑞峰，苑建磊，齊帥，等.VEGF-B及其受體Flt-1在肝癌中的表達及意義[J].中國腫瘤臨床，2009，36(5):267-271.

[3] BORG SA,KERRY KE,ROYDS JA,et el.Correlation of VEGF production with IL1 alpha and IL6 secretion by human pituitary adenoma cells[J].Eur J Endocrinol,2005,152(2):293-300.

[4] VEIKKOLA T,JUSSILA L,MAKINEN,et al.Signaling via vascular endothelial growth factor receptor-3 is sufficient for lymphangiogenesis in transgenic mice[J].EMBO J,2001,20(6):1223-1231.

[5] NATHANSON SD,ZARBO RJ,WACHNA DL,et al.Microvessels that predict axillary lymph node metastases in patients with breast cancer[J].Arch Surg,2000,135(5):586-593.

[6] 唐瑞峰,王曙霞,彭利,等.細胞因子和低氧對胰腺癌細胞表達血管內皮生長因子A、C的調節[J].腫瘤,2007,27(1):30-33.

[7] 唐瑞峰,齊帥,苑建壘,等.細胞因子IL-2和IL-6對胰腺癌細胞表達VEGF-D的調節[J].腫瘤防治研究,2009,36(8):651-654.

[8] SALVEN P,HATTORI K,HEISSING B,et al.Interleukin-1alpha promotes angiogenesis in vivo VEGF-VEGFR-2 pathway by inducing inflammatory cell VEGF synthesis and secretion[J].FASEB J,2002,16(11):1471-1473.

[9] HUANG SP,WU MS,SHUN CT,et al.Interleukin-6 increases vascular endothelial growth factor and angiogenesis in gastric carcinoma[J].J Biome Sci,2004,11(4):517-527.

[10] WEI LH,KUO ML,CHEN CA,et al.Interleukin-6 promotes cervical tumor growth by VEGF dependent angiogenesis via a STAT3 pathway[J].Oncogene,2003,22(10):1517-1527.

[11] SENBA T,KURKI M,ARAKAWA F,et al.Tumor growth suppression by a mous/human ahimteric anti-CEA antibody and lymphokine-activated killer cells in vitro and in SCID mouse xenograft model[J].Anticancer Res,1998,18(1A):17-24.

[12] SALGADO R,BENOY I,WEYUTJENS R,et al.Aterio-venous gradients of IL-6,plasma and serum VEGF and D-dimers in human cancers[J].Br J Cancer,2002,87(12):1437-1444.