不同固定方法制作大鼠眼球組織石蠟切片的比較

張亞楠，王子鳴，任廣偉，李 航，郭淺妤，張 雷*

(1.河北醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫科大學第一醫院腎內科，河北 石家莊 050031)

眼球是一種構造復雜的器官，其各部位的結構和密度不同，且各層次間的依附性和連接性較差[1]。大鼠眼球組織的石蠟切片被廣泛應用于眼科相關疾病的實驗研究，而常規石蠟切片方法極易造成眼球變形，各層次之間結構分離、移位，特別是固定液性的視網膜脫落，給組織病理學的診斷帶來很大的阻礙。對此，我們結合眼球的結構特點及以往的文獻報道[1-10]，比較了3種不同的固定方法，總結出較適合制作大鼠眼球石蠟切片的固定方法，有效地提高了大鼠眼球石蠟切片的質量，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料：動物，Sprague-Dawley(SD)大鼠，15只，雌雄不限，2～4周齡，體質量100g，購于河北省實驗動物中心。按照不同的固定方法分為A組，10只眼球，用固定液1固定；B組，10只眼球，用固定液2固定；C組，10只眼球，用固定液3固定。固定液1，體積分數95%乙醇85mL，體積分數10%中性甲醛10mL，冰醋酸5mL充分混勻[2]。固定液2，多聚甲醛4g加入0.1mol/L磷酸緩沖液100mL，加熱至60℃左右，使粉末完全溶解。固定液3，多聚甲醛4g加入0.1mol/L磷酸緩沖液80mL，加熱至60℃左右，持續攪拌，使粉末完全溶解，加少許1mol/L氫氧化鈉澄清。待冷卻后，加冰醋酸5mL、丙酮10mL，用0.1mol/L磷酸緩沖液補足至100mL[3]。

1.2 方法

1.2.1 取材與固定：將SD大鼠脫頸處死后，用無齒眼科鑷摘除眼球，保留約5mm的視神經，用角鞏膜剪剪去眼球周圍組織[4]，按照上述分組方法用不同固定液分別固定3組眼球，在固定4～5h后，用1mL注射器抽取3組各自的固定液由角鞏膜緣向眼球內注射入少量固定液。所有標本在固定24h后，用蒸餾水沖洗3次，每次30min。隨后分別在體積分數為55%、65%、75%、85%、95%乙醇中室溫脫水，各級3h，無水乙醇中脫水2次，每次2h。二甲苯透明30min，60℃浸蠟3h，包埋，低溫保存待切。

1.2.2 切片染色：用LEICA RM 2245輪轉式切片機切片，厚約5μm，40～45℃水浴展片，45℃烤片3h，快速脫蠟至水，蘇木精染液染色5min，1%鹽酸酒精分化10s，1%氨水藍化3min，1%醇溶性伊紅染液染色3min，快速梯度乙醇脫水各5min，二甲苯透明10min，中性樹膠封片，顯微鏡下進行觀察。

2 結 果

A組眼球大體結構及晶狀體保存尚可，視網膜各層結構均能顯示，但存在視網膜部分脫離、碎裂情況，視網膜各層排列疏松，有裂隙存在(圖1，2)；B組眼球結構破損，視網膜出現大面積的脫離及卷折，大量碎裂，不能清晰顯示各層細胞結構，且視網膜結構被壓縮，染色深，細胞間界限不清，晶狀體破碎，但角膜各層結構完整清晰(圖3，4)；C組眼球各層結構保持完整，無碎裂，晶狀體完整，可顯示晶狀體上皮，視網膜各層無脫離、卷折，且各層細胞排列整齊，無壓縮，染色鮮艷，層次分明，細胞界限清晰，角膜、虹膜、睫狀肌、鞏膜靜脈竇等組織結構均較清晰(圖5，6)。

3 討 論

視網膜位于眼球壁的最內層，其結構復雜，由10層結構組成。在常規石蠟切片的制作中，由于眼球各部位的結構和密度不同，質地軟硬度相差懸殊，對固定液及不同濃度乙醇處理發生的反應不同，極易造成眼球變形，各層之間結構分離、移位及視網膜脫落[5]。因此，選擇適當的固定液及脫水劑的濃度、控制好脫水時間是制作出結構完整的眼球石蠟切片的關鍵[6]。眼球標本必須將整個眼球固定后才能進行剖切，故需要固定液有很強的滲透力，能夠快速穿透眼球將各層組織固定。固定液1中含有冰醋酸和高濃度乙醇，冰醋酸的組織滲透性強[7]，但會使組織迅速膨脹，因此要求固定時間要相應縮短，乙醇對組織有收縮作用[8]，可以部分抵消冰醋酸對組織的膨脹作用。但本實驗中A組結果顯示存在視網膜部分脫離、碎裂的情況，可能是由于高濃度乙醇的收縮作用太強，過多地抵消了冰醋酸對組織的膨脹作用。固定液2為4%多聚甲醛，其固定眼球時由于滲透壓較大，對組織收縮作用強，造成眼球內外壓力不同，使眼球變形，視網膜脫落、卷折，形成固定液性的視網膜脫落[9]，但其對角膜結構的固定較為理想，具體機制還有待于進一步實驗證明。固定液3中加入了丙酮，使固定液更為溫和，組織收縮幅度小，并且滲透力迅速而均勻，組織不易出現變脆現象。實驗證明，固定液3固定的組織制作的石蠟切片的質量明顯優于固定液1、2。同時，本實驗中采用于固定4～5h后由角鞏膜緣向眼球內注射固定液的方法，一方面可以使固定液更好地向球內各層組織滲透，另一方面可以使眼球內保持一定的壓力，維持眼球的形狀，防止視網膜脫離。脫水時應從較低體積分數的乙醇開始[10]，且濃度差越小越好，逐級脫水至無水乙醇，這樣可以減少由于乙醇濃度驟升后引起的細胞收縮，避免引起視網膜脫離。同時，浸蠟時應選用熔點較低的軟蠟，以減輕因浸蠟溫度過高、時間過長引起的組織收縮。

本實驗表明固定液3的固定效果優于其他2種固定液，并且操作方法較為簡單，所用試劑均為實驗室常備試劑，無毒無害，所制作的切片結構完整，便于觀察，是固定大鼠眼球組織，制作病理切片的較好方法。(本文圖見封二)

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