錳-超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶在異丙腎上腺素所致大鼠心肌肥厚中的表達(dá)

朱玉林，米立國(guó)，郝連軍，杜建文，王瑞芬

(1.河北省邯鄲市婦幼保健院麻醉科，河北 邯鄲 056001；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050071；4.河北省承德市中心醫(yī)院超聲診斷科，河北 承德 067000；5.河北省滄州市中心醫(yī)院兒科，河北 滄州 061000)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心臟對(duì)慢性壓力或容量超負(fù)荷等因素所作出的一種代償性反應(yīng)[1-2]。大量研究[3]表明氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致心肌肥厚的重要原因。在心肌肥厚的形成和發(fā)展過(guò)程中，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多[4]。過(guò)多的ROS如不被機(jī)體及時(shí)清除，就會(huì)損害心肌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子引起細(xì)胞死亡[5]。錳-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutases，Mn-SOD)主要負(fù)責(zé)清除線粒體內(nèi)的超氧陰離子[6-7]；過(guò)氧化氫酶(catalases，CAT)主要負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫[8-9]。CAT與Mn-SOD是維持心肌正常功能所必需的抗氧化酶。以前的研究只觀察了Mn-SOD 和CAT在心肌肥厚模型中蛋白活性的改變，均未對(duì)這兩個(gè)重要抗氧化酶系基因水平的表達(dá)變化進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和取材：健康雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量(300±10)g，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)和心肌肥厚模型組(Iso 組)。參照Borges等[10]的方法,Iso組大鼠通過(guò)背部皮下注射異丙腎上腺素(5mg·kg-1·d-1),連續(xù)注射7 d制備大鼠心肌肥厚模型；對(duì)照組大鼠背部皮下只注射等體積的生理鹽水。兩組大鼠均自由進(jìn)食進(jìn)水。末次給藥24h后稱量大鼠體質(zhì)量(body weight,BW),6%水合氯醛(5mL/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈插入自制聚乙烯導(dǎo)管，穩(wěn)定后記錄右頸總收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP),計(jì)算平均動(dòng)脈壓(mean aterial pressure,MAP)；收集大鼠血液，3 000r/min離心10min,分離血清，用于血清乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH) 活性測(cè)定；開(kāi)胸取心稱量左心及全心質(zhì)量、測(cè)量左心室壁厚度。此外，將一部分心臟標(biāo)本放入液氮中用于總RNA的提取；另一部分放入固定液內(nèi)固定，用于光鏡和透射電鏡觀察。

1.2 主要試劑：LDH測(cè)定試劑盒為中生北控生物科技公司產(chǎn)品，TRIzol、RT試劑盒、Taq DNA聚合酶均為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.3 血壓測(cè)量：麻醉后固定大鼠，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入和壓力換能器相連的自制聚乙烯導(dǎo)管，穩(wěn)定后記錄右頸總動(dòng)脈SBP、DBP，計(jì)算MAP=(SBP+DBP×2)/3。

1.4 LDH活性測(cè)定:LDH活性按照試劑盒的操作說(shuō)明采用乳酸脫氫酶-乳酸(lactate dehydrogenase-lactate,LD-L)速率法測(cè)定。

1.5 測(cè)量心質(zhì)量及左心室壁厚度:大鼠麻醉后開(kāi)胸取心，用鑷子輕壓心體擠出內(nèi)部殘留血液并用冷生理鹽水洗掉表面血液，濾紙拭干后迅速置于電子天平內(nèi)稱量全心質(zhì)量(heart weight,HW)，再迅速分離左心室稱量質(zhì)量(left ventricle of heart weight,LHW)，計(jì)算心質(zhì)量指數(shù)(HW /BW，LHW/BW)。打開(kāi)左心室分離室間隔(interventricular septum，VST)與游離心室壁(left ventricular wall thickness,LVWT)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其厚度。

1.6 心肌的光鏡和透射電鏡觀察： 按照光鏡與透射電鏡的要求進(jìn)行樣品制備，分別于光鏡與透射電鏡下觀察心肌纖維形態(tài)變化,并進(jìn)行圖像分析。

1.7 Mn-SOD、CAT的mRNA測(cè)定：用TRIzol法提取心肌總RNA。以GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR。分別以Mn-SOD、CAT和GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值之比表示其mRNA的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH引物，上游，5′GCTGAGTATGTCGTGGAGT 3′，下游，5′TCTTCTGAGTGGCAGTGAT 3′；Mn-SOD引物，上游，5′TGACCTGCCTTACGACTA 3′，下游，5′CGACCTTGCTCCTTATTG 3′；CAT引物，上游，5′TATTGCCGTCCGATTCTC 3′，下游，5′ATGCCCTGG-TCAGTCTTG3′。

2 結(jié) 果

2.1 血壓：與對(duì)照組相比，Iso 組大鼠血壓明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 LDH活性：與對(duì)照組相比，Iso 組大鼠血清LDH活性明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.3 HW /BW與LHW/BW的改變：與對(duì)照組相比，Iso 組大鼠的HW/BW與LHW/BW均明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.4 VST與LVWT的改變：與對(duì)照組相比，Iso組大鼠的VST與LVWT均明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.5 心肌組織的光鏡觀察：Iso組大鼠心肌組織的HE染色切片在光鏡下可見(jiàn)大片纖維化區(qū)域，成纖維細(xì)胞多，偶可見(jiàn)單核細(xì)胞，局部區(qū)域毛細(xì)血管擴(kuò)張，心肌細(xì)胞排列不連續(xù)，胞漿變寬,胞核變大,呈現(xiàn)明顯的心肌肥厚纖維化表現(xiàn)(圖1)。對(duì)照組大鼠的心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞胞核清晰，無(wú)膠原纖維增生(圖2)。

2.6 心肌組織的透射電鏡觀察：對(duì)照組大鼠心肌纖維明帶、暗帶結(jié)構(gòu)清晰，肌節(jié)長(zhǎng)度適中，肌纖維排列整齊，線粒體數(shù)量結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常(圖3)。心肌肥厚模型組大鼠線粒體數(shù)量較多，線粒體嵴增多密集，線粒體腫脹，個(gè)別線粒體出現(xiàn)空泡樣變，心肌纖維內(nèi)肌絲有溶解現(xiàn)象，心肌纖維間隙增寬、成纖維細(xì)胞明顯，間隙內(nèi)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞(圖4～6)。

2.7 Mn-SOD、CAT的 mRNA表達(dá)變化：與對(duì)照組相比，Iso組大鼠心肌組織內(nèi)Mn-SOD、CAT的mRNA表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

GroupsMAP(kPa)LDH (U/L)HW/BW(mg/g)LHW/BW(mg/g)LVWT(mm)VST(mm)Control10.21±0.81514.83±13.433.05±0.232.33±0.113.56±0.182.44±0.07Iso14.05±1.19?876.66±9.52?4.51±0.39?3.26±0.25?4.33±0.31?3.11±0.19?

*P<0.01vscontrol group byttest

MAP:mean arterial pressure;LDH:lactate dehydrogenase;HW/BW:heart weight/body weight;LHW/BW:left ventricle of heart weight/body weight;LVWT：left ventricular wall thickness;VST:interventricular septum;Iso:isoproterenol

GroupsMn-SODCATControl0.625±0.0950.763±0.129Iso0.998±0.154?1.051±0.143?

*P<0.05vscontrol group byttest

Mn-SOD:manganese superoxide dismutases;CAT:catalases;Iso:isoproterenol

3 討 論

心肌肥厚是多種心血管疾病所具有的共同病理過(guò)程，如不及時(shí)治療會(huì)發(fā)展成心功能衰竭。因此，對(duì)心肌肥厚發(fā)病機(jī)制的探討一直是心血管研究的重點(diǎn)之一。到目前為止，對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的研究主要是通過(guò)動(dòng)物模型來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Iso是一種β受體激動(dòng)劑，可增強(qiáng)心肌收縮力，加快心率，使心肌耗氧量明顯增加，并能促進(jìn)心肌細(xì)胞總蛋白和非收縮蛋白合成,使心肌細(xì)胞肥大，膠原纖維增生，導(dǎo)致心肌肥厚的形成[11-12]。本研究結(jié)果顯示，在給大鼠注射7d Iso后，HE和電鏡結(jié)果均提示大鼠出現(xiàn)心肌肥厚的病理改變；同時(shí)，Iso組大鼠的血壓升高，HW/BW、LHW/BW、LVWT、VST等均明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)心肌肥厚的發(fā)生；此外，血清內(nèi)LDH活性明顯升高，說(shuō)明此時(shí)心肌細(xì)胞已嚴(yán)重受損，導(dǎo)致釋放入血的LDH增多，活性升高。以上這些結(jié)果均表明使用Iso誘導(dǎo)的心肌肥厚模型是成立的。

在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，心肌細(xì)胞消耗的能量明顯增強(qiáng)。機(jī)體通過(guò)加強(qiáng)線粒體氧化磷酸化來(lái)增加三磷酸腺苷的合成，滿足心肌過(guò)多的能量消耗。但在這個(gè)過(guò)程中從電子傳遞鏈泄漏的ROS也會(huì)隨之增多。它們可以使生物膜內(nèi)的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),改變生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。此外，ROS還可損傷線粒體的結(jié)構(gòu)和功能,使三磷酸腺苷合成減少,加重心肌能量缺乏,進(jìn)一步促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。這可能是我們建立的大鼠心肌肥厚模型出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞受損、心肌肥厚纖維化等病理改變的直接原因。同時(shí)，Mn-SOD和CAT的mRNA表達(dá)水平在心肌肥厚模型組大鼠明顯增強(qiáng)。推測(cè)：當(dāng)心肌肥厚等病理改變發(fā)生后，心肌組織內(nèi)ROS的產(chǎn)生量明顯增多，此時(shí)機(jī)體通過(guò)上調(diào)Mn-SOD、CAT的基因表達(dá)水平，增加其生成量來(lái)清除過(guò)多的ROS，保護(hù)心肌細(xì)胞免遭損傷，防止心肌肥厚的進(jìn)一步發(fā)展。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SOD和CAT 2個(gè)抗氧化酶在心血管疾病防治中的重要作用，這將為心肌肥厚防治方法的研究提供一定的理論參考。(本文圖見(jiàn)封二)

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