煙草 TILLING 技術體系的建立及 NtPhyB 基因的篩選

宗 鵬，李鳳霞，王 倩，劉貫山，龔達平，陳雅瓊，孫玉合*

(1.中國農業科學院煙草研究所,煙草行業基因資源利用重點實驗室,青島 266101；2.中國農業科學院研究生院,北京 100081)

煙草 TILLING 技術體系的建立及 NtPhyB 基因的篩選

宗 鵬1,2，李鳳霞1，王 倩1，劉貫山1，龔達平1，陳雅瓊1,2，孫玉合1*

(1.中國農業科學院煙草研究所,煙草行業基因資源利用重點實驗室,青島 266101；2.中國農業科學院研究生院,北京 100081)

定向誘導基因組局部突變技術(Targeting Induced Local Lesions In Genomes，TILLING)是一種新近發展起來的高通量檢測點突變的反向遺傳學方法。本研究首次將 TILLING 技術用于 EMS 處理的煙草突變體篩選中，通過對正反向熒光引物使用量的摸索，確定了 10 μL PCR 體系中 IRDye-700 標記的正向引物(1 μM)適用量為 0.32～0.64 μL，IRDye-800 標記的反向引物(1 μM)適用量 1.12～1.6 μL；對異源雙鏈 CEL Ⅰ酶切體系實驗表明，10 μL PCR 產物中加入 0.6 μL CEL I 酶，1.5 μL 10× Buffer酶切效果最好。從而建立并優化了適用于普通煙草基因組研究的 TILLING 技術體系。在此基礎上，以 NtPhyB為目標基因，在 1000 份 0.6% EMS 誘變的 M2 突變體中進行篩選，共得到 13 個突變體，該基因突變頻率約為 1/94 kb。本試驗建立的 TILLING 篩選體系能夠快速、高效地篩選任意已知序列基因的突變體，對煙草功能基因組研究具有重要意義。

功能基因組學；TILLING；煙草；化學誘變；突變體

定 向 誘 導 基 因 組 局 部 突 變 技 術 (Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING)是一種高效地對化學誘變產生的突變體進行篩選的方法,它能夠對基因組任何一個基因進行定點突變,通過創建特定基因的突變體來研究一個基因的功能。由于這類突變群體具有低水平的異倍性、致死率和高密度的突變率[1],在功能基因鑒定和分子輔助育種中有很大優勢。TILLING 現已經成功應用于擬南芥、小麥、玉米、水稻、大豆等很多動植物突變體篩選中[2-18]。

TILLING 技術檢測經典方法為熒光引物標記法,其核心是對突變位點處形成的異源雙鏈進行特異性酶切,再通過 700、800 nm 波長下雙色紅外熒光檢測酶切片段的大小確定突變位點,由于此方法紅外熒光檢測干擾低,因此該方法具有假陽性低、成本低、通量較高等優點。目前擬南芥 TILLING項目(Arabidopsis TILLING Project, ATP)、百脈根(Lotus japonicus)TILLING 項目以及在水稻、小麥等植物上進行的突變體篩選均是利用該方法進行[1-2,6,18],通過該方法分離、鑒定了大量與生長發育、農藝性狀等相關的基因[1-2],加快了其功能基因研究速度。

煙草是一種重要的經濟作物,也是植物生物技術研究的模式植物。2011 年中國農業科學院煙草研究所構建了數萬份普通煙草 EMS誘變的飽和突變體庫,可以進行大規模的煙草功能基因鑒定。本項目通過摸索煙草 TILLING 的異源雙鏈酶切、PCR反應中熒光引物的相對含量等條件,建立并優化煙草突變體 TILLING 篩選方法,并用于煙草 NtPhyB基因的篩選,該方法的建立將為大規模進行煙草發育、品質、抗病、煙堿代謝等相關基因的突變體篩選、基因功能鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為 0.6% EMS 處理的中煙 100 M2 代突變體共 1000 個株系,2011 年種植于山東省諸城市。TILLING 檢測采用 DNA 分析儀(Licor4300, American)進行,變性 PAGE 膠、標記 Marker購自GENE 公司。熒光標記引物由寶生物工程(大連)公司合成,普通引物由 Invitrogen 公司合成。

1.2 TILLING 篩選體系方法

1.2.1 DNA 提取、均一化和 DNA 四倍池的建立M2突變單株DNA的提取采用TIANGEN試劑盒進行,通過瓊脂糖電泳以及紫外分光光度法測定DNA濃度和質量,并將每個 DNA 濃度稀釋至 40 ng/μL。取 M2 單株 DNA 20 μL,每 4 個單株混于 96 孔板中一個孔,構建四倍混合池。

1.2.2 PCR 擴增及異源雙鏈的重組 根據絨毛狀煙草和林煙草中煙草 II型光敏色素基因(Nicotiana tabacum type II phytochrome gene, NtPhyB)的序列,利 用 CODDLE(Codons Optimized to Discover Deleterious Lesions; http∶//www.proweb.org/input/)程序設計引物 NtPhyB-F:5'-CTTTTTCAACTTAATAT CTTTTA-3'；NtPhyB-R:5' -CTAGCAGAAGTATGG TGTCCAAC-3'。10 μL PCR 反應體系為:DNA 模板 1 μL；NtPhyB-F-IRDye700 0.032 μL；NtPhyB-F 0.128 μL；NtPhyB-R-IRDye800 0.288 μL；NtPhyB-R 0.032 μL；10× Buffer 1 μL；2.5 mM dNTP 1 μL；TAKARA Ex Taq 0.1 μL；ddH2O 8 μL；

PCR 反應程序為:95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s, 57 ℃ 30 s,每個循環降低 1 ℃,72 ℃ 1 min；10 個循環；94 ℃ 20 s,47 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min；45 個循環；72 ℃ 5 min；99 ℃ 10 min；70 ℃ 20 s,每個循環降低 0.3 ℃,70 個循環。

1.2.3 CEL I 酶切重組異源雙鏈及酶切產物的純化CEL I 酶的提取參照韓鎖義的方法[19]。設置 12 種CEL I酶切體系切割陽性對照(表1),酶切條件為45 ℃,30 min,酶切完成后用 5 μL 的 0.25 M EDTA終止反應。在 15 μL 酶切產物中加入 25 μL H2O 和60 μL 異丙醇,-20 ℃過夜后,2400 g 平板離心 45 min后,倒掉上清液,加入 100 μL 70%乙醇洗脫,離心30 min,倒掉上清,晾干。待產物晾干后,向其加入 5 μL Blue Stop solution Buffer溶解。

表1 CEL I酶濃度梯度Table 1 Different concentration of the CEL I enzyme in Licor-TILLING system

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 變性聚丙烯酰胺凝膠制備用 6% Gene-PAGE Plus 20 mL,向其加入 15 μL TEMED 和 100 μL 10%過硫酸銨,混勻后迅速均勻地倒入膠板中,邊倒邊輕輕捶打,避免產生氣泡,待膠均勻地充滿膠板后,插上梳子,室溫下放置 1.5～2 h。在點樣之前,樣品 95 ℃變性 2 min后放置冰上,吸取 0.5 μL 加入點樣槽。電泳條件:預電泳電壓,1500 V,電流 40 mA,功率 40 W,時間 10 min；電泳時電壓 1500 V,電流 40 mA,功率40 W,時間 195 min,溫度設置為 50 ℃,GelBuddy圖像分析(Licor4300, American)軟件分析電泳結果。

1.2.5 突變單株測序驗證及突變頻率分析 將有突變位點的混合池中的 4個單株分別進行酶切檢測,獲得有突變位點的突變個體,并對其 PCR 產物雙向測序,獲得突變位點信息。計算 NtPhyB 在突變群體的突變頻率,計算公式為:突變頻率=1/(篩選片段總長×篩選模板數目/篩選出突變位點個數)。

2 結 果

2.1 DNA 提取、濃度均一化

采用 TIANGEN試劑盒提取的DNA質量較好, DNA 濃度在 41～200 ng/μL 之間,將 DNA 樣品根據其原始濃度用雙蒸水稀釋至 40 ng/μL,用于四倍混合池的構建(圖 1)。

圖1 DNA 質量的檢測與稀釋Fig. 1 Determination of DNA quality and it's dilution to desired concentration注:左側為稀釋前 DNA,上樣品 3 μL；右側為濃度均一化后的 DNA,上樣品 5 μL。

2.2 熒光標記引物用量對檢測結果的影響

PCR 反應體系中熒光標記引物使用量決定了電泳圖譜的清晰度,直接影響著突變位點的鑒定結果,在本試驗中,10 μL PCR 體系中加入 0.32～0.64 μL 1uM 的熒光標記的正向引物 NtPhyB-F-700,同時混合 0.96～1.28 μL 1uM 的非標記正向普通引物NtPhyB-F；1.12～1.6 μL 1uM 的熒光標記的反向引物 NtPhyB-2R-800,同時混合 0.16～0.48 μL 1uM 的反向普通引物 NtPhyB-R,電泳圖譜較好(圖 2)。

2.3 TILLING 篩選體系 CEL Ⅰ酶切割雜合雙鏈

CEL Ⅰ酶具有對堿基錯配的 DNA 雙鏈在堿基錯配處進行準確切割的功能,用 12 種酶切體系切割已知堿基錯配的 PCR 產物(表1),得到最適合用于煙草 TILLING 的 CEL Ⅰ酶量:IV 號酶切體系(10 μL PCR 產物,0.6 μL CEL I酶,1.5 μL 10× Buffer,2.9 μL ddH2O)適合用于煙草 TILLING 中(圖 3)。

圖2 不同熒光引物使用量的檢測電泳圖Fig. 2 Different intensity of fluorescence produced by fluorescent-marked primer.注:左側為 700 nm 通道,右側為 800 nm 通道；框內表示適宜的熒光引物濃度范圍。

圖3 檢測 CEL I濃度梯度酶切結果Fig. 3 Digestion of heteroduplex PCR products by different concentrations of CEL I enzyme注:Marker 為 Transgen 公司 DL2,000。白色箭頭指出的為酶切后的一條帶。I 為空白對照,排除了其為 PCR 擴增非特異帶。I,II,III,IV, V,VI,VII,VIII,IX,X,XI,XII 對應表2 酶切體系。

2.4 TILLING 體系篩選四倍庫結果

用上述 PCR 擴增體系和酶切體系篩選 M2 代DNA 四倍混合池,通過 LICOR-4300 檢測,700 nm通道電泳圖譜和 800 nm 通道電泳圖譜在同一電泳道上,各出現一個特異條帶,且兩個條帶的大小之和等于主帶大小,表明此 DNA 混合四倍池中有突變體(圖 4)。在 250 個混合池中,共獲得了 13 個含有 NtPhyB 基因突變位點的混合池。

2.5 確定 NtPhyB 突變單株及突變頻率

將檢測到的含有 NtPhyB 基因突變的四倍體混合池中各突變單株 DNA 與 20 ng/μL 的野生型中煙100 混合,再經過異源雙鏈形成和 CEL I酶切過程,確定了 NtPhyB 基因的 13 個突變單株(圖 5),該基因在群體的突變頻率=1/(1223×1000/13)≈1/94 kb。

圖4 TILLING 篩選四倍庫 NtPhy 基因突變體電泳圖Fig. 4 The output of NtPhy mutations screened through Licor-TILLLING system in tetraploidy pools注:左側為 700 nm 通道,右側為 800 nm 通道。方框中框出的兩個突變條帶,并在最右邊進行了放大。

圖5 Licor-TILLING 確定 NtPhy 突變單株電泳圖譜Fig. 5 The spectrum of NtPhy mutations in mutant plants by Licor-TILLING system.注:左側為 700 nm 通道,右側為 800 nm 通道。在同一泳道,兩張圖譜被分離的片段大小之和等于主帶,表示此處有點突變。

3 討 論

3.1 熒光引物用量

基 于 Licor 4300 的 基 因 分 析 系 統 在 進 行TILLING 篩選時,熒光信號強弱直接影響著圖譜質量,若 PCR 反應體系中全部為熒光標記引物或者使用的熒光引物過多,不僅會造成電泳圖譜色深,對電泳條帶的觀察造成干擾,而且成本增加；若使用的熒光引物過少,則導致電泳圖譜色淺,可能觀察不到電泳條帶。另外,Dye800 的熒光信號比 Dye700低,因此,調整兩種引物的含量非常重要。Colbert T 等[20]的研究表明,當將一對分別用 700、800 nm熒光染料標記的引物和沒有標記的引物混和后進行PCR擴增時,擴增產物會非常穩定,因此,可以通過在 PCR 體系中加入一定量的普通引物來平衡熒光引物的使用量,來調整圖譜效果。在擬南芥、水稻 TILLING 體系中,熒光引物與普通引物比例一般為正向引物 3∶2,反向引物為 4∶1[21-22]。通過摸索,我們確定了煙草 10 μL PCR 體系中熒光引物與普通引物比例約為正向引物比例為 2∶3,反向引物比例約 7∶1。實驗結果與水稻體系略有不同,可能是同一種熒光標記引物,不同公司合成的熒光標記引物熒光信號強度也不同。

3.2 突變頻率對煙草功能基因研究的影響

本研究中,NtPhyB 基因在 0.6% EMS 處理的M2 代突變群體的突變頻率約為 1/94 kb,這意味著在一個普通煙草突變株中,整個基因組上約有46 000 個左右的突變位點。這種突變頻率與四倍體小麥 1/40 kb[2]比較接近,而與二倍體植物如擬南芥、水稻的突變頻率(1/170 kb、1/500 kb)相差較大。本研究中普通煙草較高的突變頻率可能與其是多倍體有關,由于多倍體中同源基因的存在,使其對點突變的耐力增強,所以飽和突變體庫中點突變頻率較高。較高的突變頻率,可以保證在相對較少量的突變群體里包含豐富的突變類型,但較高的突變頻率也使得表型分析相對困難,尤其對功能未知的基因,確定其突變表型與基因突變的相關性有一定的難度。

3.3 TILLING 技術在煙草上的應用前景

TILLING 技術依賴于飽和突變群體材料和完整的基因序列信息。目前,普通煙草有數萬份的飽和突變體材料,其祖先親本絨毛狀煙草(N. tomentosiformis)和林煙草(N. sylvestris)的全基因組也已經測序完成,理論上普通煙草任意基因的突變體都可以找到。然而,TILLING 技術應用于煙草功能基因鑒定又有一定的困難,首先,多拷貝基因的存在使得普通煙草突變基因功能驗證比二倍體難度高,往往需要同時篩選相似性較高的幾個或幾十個基因,篩選和鑒定的工作量比較大；其次,煙草是一種注重品質的作物,在篩選控制次生代謝的功能基因突變體時,表型分析即相應代謝產物的變化檢測較為復雜。因此,利用 TLLING 技術鑒定普通煙草基因功能,還要從簡單、易檢測的性狀入手,再逐步深入。

4 結 論

本研究通過對正反向熒光引物使用量的摸索以及異源雙鏈 CEL Ⅰ酶切體系實驗,建立并優化了煙草 TILLING 篩選體系。并利用該體系在 1000 份突變體中進行篩選,得到了 13個突變單體,預測該基因突變頻率約為 1/94 kb。本研究對未來煙草重要功能基因分析奠定了重要基礎。

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Establishment of TILLING in Tobacco and its Application to Screen the NtphyB Gene in Mutant Populations

ZONG Peng1,2, LI Fengxia1, WANG Qian1, LIU Guanshan1, GONG Daping1, CHEN Yaqiong1,2, SUN Yuhe1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a newly developed high-throughput reverse genetic method used for detection of point mutations. We used TILLING technology to screen EMS treated tobacco mutant population. The concentration of forward and reverse fluorescent labeled primers was determined∶ the 10 μL PCR mix consisted of 0.32 ～ 0.64 μL (1 μM) fluorescence-labeled forward primer and 1.12 ～ 1.6 μL (1 μM) fluorescence-labeled reverse primer. The 10 μL PCR product was used as a substrate for the CEL I digestion. The concentration of CEL I enzyme and 10× buffer optimized to cut the heteroduplex was 0.6 μL and 1.5 μL respectively. This optimized and established TILLING system was applied to screen the NtPhyB gene in 1000 (0.6% EMS mutagenized) M2 mutant population. The screening procedure provided a total of 13 mutants. The gene mutation frequency of approximately 1/94 kb was obtained. TILLING screening system established in our study is faster and efficient for mutant genes of any known sequence and can play a vital role in tobacco functional genomics research in future.

functional genomics; TILLING; tobacco; chemical mutagenesis; mutant

S572

1007-5119(2014)02-0032-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.006

中國煙草總公司煙草基因組計劃重大專項項目―煙草突變體庫創制、篩選與分析”[110201101009(JY-03)]；―煙草突變體篩選與鑒定”[110201201004(JY-04)]；―煙草突變體庫創建與功能基因組學研究”(110200701022)

宗 鵬,男,碩士研究生,研究方向為分子育種。E-mail:zongpeng037@163.com。*通信作者,E-mail:yhsun@163.com

2013-02-21

2013-12-17