青霉菌滅活菌絲體誘導煙草抑制消減雜交 cDNA 文庫的構建.

陳壯壯，謝 虹#，鐘 宇，張鵬遠，龍春瑞，陳 林，王建光*，陳穗云*，李秀軍

(1.云南大學生命科學學院 昆明 650091；2.昆明保騰生化技術有限公司 昆明 650106)

青霉菌滅活菌絲體誘導煙草抑制消減雜交 cDNA 文庫的構建.

陳壯壯1，謝 虹1#，鐘 宇1，張鵬遠1，龍春瑞1，陳 林1，王建光1*，陳穗云1*，李秀軍2

(1.云南大學生命科學學院 昆明 650091；2.昆明保騰生化技術有限公司 昆明 650106)

為了探究青霉菌滅活菌絲體(DMP)在煙草抗性中的作用機制，以 DMP 水溶液處理的煙草紅花大金元葉片為材料，利用抑制消減雜交(SSH)技術構建了 cDNA 文庫，并對文庫進行了分析。SSH 獲得 356 個克隆，挑選 102 個克隆，測序成功 77 個。Blastn 比對出 47 個不同功能的基因。Blastx 比對出 26 個不同功能的蛋白；7 種未知功能的預測蛋白；2 個克隆沒有比對出相關蛋白。所有克隆抗病防御、能量代謝和細胞保護相關基因較多，分別占總數的 40.3%、23.4%和 14.9%。其余有關細胞結構、蛋白合成、轉錄及信號傳導的基因相對較少，分別占到 8.5%、4.3%、4.3%和 4.3%。

青霉菌滅活菌絲體；烤煙；紅花大金元；cDNA 文庫；SSH

我國是世界最大的煙草生產國,煙草栽培和卷煙制品產量均為世界第一位[1]。云南煙草的種植面積、產量、質量、卷煙銷售和市場占有量均居全國首列,是云南省的支柱產業[2]。但是,隨著栽培條件的變化,煙草病害的危害也日益嚴重,造成了巨大的經濟損失。另一方面,為了控制病害的發生,化學農藥被廣泛使用,造成了煙葉中農藥殘留的增加,病害的抗藥性增強和病害的再猖獗,嚴重影響了農業的可持續發展,破壞了生態平衡。生物防治因具有無污染、不增加抗藥性而逐漸受到人們的重視,近年來已成為煙草病害防治的一種重要手段。

青 霉 菌 滅 活 菌 絲 體 (Dry Mycelium of Penicillium chrysogenum, DMP)是生產青霉素后的殘余產物,以色列等國家利用其制成一種非常優良的有機肥。以色列的 Cohen 等實驗室首先發現在溫室盆栽條件下,該物質可誘導甜瓜、西瓜和棉花對枯萎病和黃萎病的抗性顯著提高；同時誘導植物體內與抗病相關的過氧化物酶、輔氨酸、木質素等含量顯著提升[3-5]。瑞士 Thuerig 等也報道,以該殘渣處理后,可以提高包括蘋果、葡萄、馬鈴薯、黃瓜、洋蔥等對多種病害的抵抗能力,誘導擬南芥中大量抗性基因的表達[6]。實驗室前期研究發現青霉菌滅活菌絲體能夠誘導棉花產生系統抗性,導致抗性基因的大量表達和上調[7],大田試驗表明青霉菌滅活菌絲體對煙草黑脛病和煙草花葉病有良好的防治效果[8-9]。2007—2012 年在云南煙區累計推廣面積達 40,000 hm2。可見青霉菌滅活菌絲體是良好的抗性誘導劑,但其具體的誘導機制和信號通路途徑尚不明確。

抑 制 消 減 雜 交 技 術(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)由 Diatchenko 等在 1996 年建立,利用該技術構建cDNA 文庫有助于抗病相關基因的篩選和分析[10-11]。Chacon 等[12]利用 SSH 技術研究了麥格隆熄豐煙參與抵抗黑脛病的抗性基因。蘇格蘭農作物研究中心等使用 SSH 法將冬眠馬鈴薯的發芽部位和塊莖部位分別作為檢測子和驅動子構建消減文庫,找出了一系列與生長調節相關的基因。并繼續重點研究了其中一個植物生長因子,證明它在植物發芽部位有高表達[13],為茄屬植物的進一步研究奠定了基礎。利用 SSH 技術,是獲得植物抗性和功能基因的有效手段。

本研究通過 SSH 構建 DMP 誘導的煙草 cDNA文庫,分析文庫中相關克隆,探究 DMP在煙草抗性中的作用機制,進而探究信號通路途徑,為DMP誘導相關抗性基因的篩選和研究搭建平臺,同時為DMP誘導其他作物抗病研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

煙草紅花大金元包衣種子由玉溪中煙種子有限責任公司提供。在云南大學生命科學學院溫室內采用漂浮育苗技術將煙苗培育至 5～6 葉期,隨后將長勢一致的健康煙苗轉移到培養瓶培養 3～4 d。DMP 由昆明保騰生化技術有限公司提供。處理組(Tester組)用 0.4%DMP 水溶液處理 72 h 后采樣；對照組(Driver 組)為清水處理。取新鮮葉片置于-80 ℃冰箱保存備用。以 DMP 處理 72 h 的紅花大金元 cDNA 樣本為待測子(Tester),以清水處理對照組煙葉 cDNA 為驅動子(Driver)。

實驗中所需試劑盒均由 Clontech 提供。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 消減抑制雜交 使用 Trizol(invitrogen)提取煙葉總 RNA,RNA 樣品測定濃度和純度,并用1.0%瓊脂糖凝膠變性電泳檢測其質量。Clontech SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit和 Clontech Advantage 2 PCR Kit用于 cDNA 和 ds-cDNA 的合成及純化。消減抑制雜交按 Clontech PCR-SelectTMcDNA Substraction Kit 試劑盒說明進行。

1.2.2 消減 cDNA 文庫的構建 消減雜交后產物與pGEM-T Easy(Promega)載體連接,重組載體轉化大腸桿菌 JM109。通過藍白斑篩選陽性克隆,選取含有插入片段的陽性克隆送北京華大基因公司進行序列測定。PCR 檢測載體和重組子質量用于消減cDNA 文庫的質量分析。

1.2.3 DNA 序列分析 測定序列在 NCBI 上進行Blastn 和 Blastx 比對分析(www.ncbi.nlm.nih. gov/)。

2 結 果

2.1 總 RNA 檢測

瓊脂糖凝膠變性電泳檢測結果顯示,處理組和對 照 組 煙 葉 總 RNA 條 帶 清 晰 (圖 1)； 由nanodrop2000 測定 RNA 濃度和純度。處理組 RNA濃度為 1 758 ng/μL,純度 260/280 為 2.06；對照組濃度為 1 460 ng/μL,純度 260/280 為 1.93,總 RNA質量能滿足以下實驗要求。

2.2 cDNA 純化和酶切

合成 ds-cDNA 后,將得到的 ds-cDNA 過柱純化,瓊脂糖凝膠檢測純化產物符合預期大小和分布(圖 2)。將富集純化產物用限制性內切酶 RsaI 消化處理,瓊脂糖凝膠檢測(圖 3)結果表明,產物酶切后片段大小主要分布于 250～1 000 bp。

圖1 總 RNA 提取結果Fig.1 Result of total RNA

圖2 柱純化結果，A 為處理組純化，B 為對照組純化。M：DNA Markers，1：LD-PCR 擴增產物；2、3、4 分別為洗脫第一、二、三部分Fig. 2 Result of column chromatography. A∶ Column chromatography of tester; B∶ Column chromatography of driver. M∶ DNA Markers, lane 1∶ Result of LD-PCR, lane 2∶ First part of eluting, lane 3∶ Second part of eluting, lane 4∶ Third part of eluting.

圖3 RsaI酶切結果Fig. 3 Result of RsaI Digestion. M:DNA Markers, lane 1∶ Result of LD-PCR of driver, lane 2∶ Result of RsaI digestion of driver, lane 3∶ Result of LD-PCR of driver, lane 4∶ Result of RsaI digestion of test注:M:DNA Markers；1:對照組 LD-PCR 擴增產物；2:對照組酶切產物；3:處理組 LD-PCR 擴增產物；4:處理組酶切產物。

2.3抑制消減雜交cDNA文庫質量分析

藍白斑篩選共獲得 356 個單克隆,隨機挑選 50個進行菌液 PCR,克隆片段主要集中于 250～1 000 bp(圖 4),表明 cDNA 文庫質量良好,可用于后續實驗。

2.4序列測定與分析

本研究應用 DMP處理煙草,成功構建了紅花大金元煙葉抑制消減正向文庫,包括 356 個克隆,文庫的滴度達到 2.2×109cfu/ml,挑選均勻飽滿、清晰的 102 個陽性克隆進行 DNA 序列測定,測序成功 77 個,陽性克隆比例為 75.4%,并將其在 NCBI上應用 Blastn 和 Blastx 進行比對分析,最終比對出46 個克隆基因包含 26 個不同功能的蛋白質(表1),另外7種蛋白質是預測功能；一個克隆有同源序列,但無同源蛋白質；一個克隆沒有同源序列也沒有同源蛋白質。

Blastx 結果表明,比對出的 26 個不同功能的蛋白質中(圖 5)抗病防御的相關功能基因最多,達到已知功能基因總數的 40.3%,其次是能量代謝和細胞保護的基因,達到 23.4%、14.9%,其余的有關細胞結構、蛋白合成、轉錄相關及信號傳導的相應較少,分別占到 8.5%、4.3%、4.3%和 4.3%,由此可以看出,DMP能誘導煙葉大量表達抗逆性基因,增強能量代謝,加強免疫應答過程等方式來有效提高煙草的抗性。

從基因的出現頻率來看,響應 ABA 的蛋白出現了 14 次,光合系統組分出現了 4次,硝酸還原酶出現了3次,類泛素載體蛋白出現了2次,核糖體組分蛋白出現了 2 次,其余功能蛋白出現了 1 次。

3 討 論

圖4 部分菌液 PCR 結果Fig. 4 Part result of RCR. Each lane represents the result of randomly selected clone ext.注:各個電泳條帶為隨機挑選的克隆提取結果。

表1 測序基因同源比較結果Table 1 Results of gene sequencing homology comparison

抑制消減雜交(SSH)方法作為一種 mRNA 水平上的差異表達克隆技術,具有操作簡單,靈敏度高,檢測效率高,假陽性較低等的優點,已在生物學科學研究工作中得到較廣泛的應用[14]。本研究應用SSH 技術,有效分離 DMP 誘導處理煙草 72 h 的差異基因表達,這些基因主要涉及抗病防御、能量代謝、細胞保護、細胞結構、信號轉導、蛋白合成和轉錄調控。

抗病防御基因是本研究獲得基因總數最多的,約占文庫總數的 40.3%,主要包括響應 ABA 蛋白基因、細包壁相關水解酶基因、齒質唾液磷酸蛋白和硝酸還原酶基因。ABA不僅可以作為植物胞間信號物質介導植株整體的抗逆反應,也能作為細胞逆境信號物質直接介導許多抗逆基因的表達[15]。擬南芥中 ABA 參與多條信號通路的調控,如激活茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯(ethylene, ET)的應答基因 VSP2；抑制水楊酸(salicylic acid, SA)通路的 PR 蛋白表達等[16]。前期研究結果表明,DMP能誘導棉花葉片 PR 基因的表達[4],近期,我們在DMP處理的煙草中也檢測到 PR基因的表達,這些現象說明 DMP 可能誘導了 JA、ET 和 SA 信號轉導途徑,同時可能還存在另外一條未知的信號途徑。

本文庫中也篩選到了一系列的與信號轉導過程有 關 系 的 基因,如 ADP 核 糖 基化 因 子(ADP-ribosylation factor, ARF),蛋白激酶,以及硝酸還原酶。ARF參與細胞內物質運輸和信號轉導過和,具有重要的生理功能[17-18]；蛋白激酶在信號轉導中主要通過磷酸化調節蛋質的活性和蛋白質逐級磷酸化,使信號逐級放大,最后誘導某些在生理生化上有特定功能的基因進行表達,對脅迫做出各種適應性反應[19-20]。硝酸還原酶參與植物的生長、發育、衰老和抗病等生理代謝過程,并作為第二信使激活各種抗病防衛基因的表達[21-23]。

類泛素載體蛋白和谷胱甘肽過氧化物酶都為細胞保護相關基因。泛素化廣泛地參與了茉莉酸、水楊酸和乙烯的信號傳導和生物合成等環節[24],在植物免疫應答相關的各個途徑中均發揮重要作用。而谷胱甘肽過氧化物酶對不同的非生物脅迫都有應答反應[25-26],是植物抗氧化酶系統中的重要一員,可增加植物的抗逆性。

除了上述參與抗病防御、信號轉導和細胞保護等基因,還分離到了與能量代謝、細胞結構和蛋白合成等基因,這些基因都與植物的生長發育有密切關系,其作用和功能還有待進一步研究,同時,對參與抗病防御、信號轉導差導表達基因還需作定量分析和功能驗證。

圖5 cDNA 文庫 Blastx 比對結果Fig. 5 The result of Blastx

4 結 論

青霉菌滅活菌絲體能誘導煙葉抗病防御、能量代謝、細胞保護、細胞結構、蛋白合成和信號轉導等基因表達,其中與抗病防御、能量代謝和細胞保護相關的基因占 78.6%,說明 DMP 能激活和誘導煙草細胞保護和抗病防御基因大量表達,同時也能啟動相關信號轉導途徑使能量代謝處于活躍狀態,提高光合效率,增加細胞供能維持大量細胞合成和正常生理系統運轉。

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Establishment of a Suppression Subtractive Hybridization cDNA Library of Tobacco Induced by Dry Mycelium of Penicillium Chrysogenum

CHEN Zhuangzhuang1, XIE Hong1#, ZHONG Yu1, ZHANG Pengyuan1, LONG Chunrui1, CHEN Lin1, WANG Jianguang1*, CHEN Suiyun1*, LI Xiujun2
(1. School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650091, Yunnan, China; 2. Baoteng Biochemical Technology Co.,Ltd., Kunming 650106, Yunnan, China)

Dry mycelium of Penicillium chrysogenum (DMP) could protect plant from disease. But its mechanism of induction and signaling pathways was unclear. Analyzing the genes expression in the plant treated by DMP was a good way to find out how inducing agent works. SSH technology was used to establish a cDNA library of tobacco induced by Dry mycelium of Penicillium chrysogenum. In the library 356 positive clones were obtained, of which 102 clones were selected for sequencing and 77 were sequenced successful. The result of Blastn showed that 47 genes’ functions were obtained in the library. The result of Blastx indicated that 26 genes had homologous sequences and 7 genes showed high similarities with putative proteins; 2 genes did not get any homologous sequence or protein. Defense-related genes (40.3%) were most in the library; The energy metabolism and the cytoprotective genes were in the next place (23.4% and 14.9% respectively). The genes related to eucaryotic cell structure, protein synthesis, transduction and signal transduction were fewer (8.5%, 4.3%, 4.3% and 4.3% respectively). DMP can induce numerous genes expression in tobacco. Masses of genes are related to plant growth and stress resistance.

Dry Mycelium of Penicillium Chrysogenum; Nicotiana tabacum; Honghuadajinyuan; cDNA library; SSH

S435.72

1007-5119(2014)02-0026-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.005

云南省煙草公司項目(2011YN60,2012YN10,2012YN13,2012YN36,2013YN36,2011YN09)；國家自然科學基金(31101416)；云南大學生命科學學院植物科學研究所青年基金(ZW201002)；云南大學理(工)科校基金(2010BY007)

陳壯壯,男,碩士研究生,研究方向為植物學,E-mail:chen090330@163.com。#與第一作者同等貢獻；*通信作者,E-mail:jgwangyn@yeah.net

2013-11-27