不同生長物質復配處理對烤煙種子萌發的影響

屈 旭，丁安明，劉少云，呂國新，王永利，許永幸，李毅君*

(1.青島中煙種子有限責任公司,青島 266101；2.中國農業科學院煙草研究所,青島 266101；3.山東青島煙草有限公司,青島 266101)

不同生長物質復配處理對烤煙種子萌發的影響

屈 旭1,2，丁安明2，劉少云1,2，呂國新3，王永利3，許永幸3，李毅君1,2*

(1.青島中煙種子有限責任公司,青島 266101；2.中國農業科學院煙草研究所,青島 266101；3.山東青島煙草有限公司,青島 266101)

為了更好地提高煙草催芽種子的質量，尤其是改善陳種子的萌發能力，實驗采用不同濃度的 MS 營養液、GA3、IBA、6-BA 及 4 者復配對 K326、NC89 新陳 2 類種子進行催芽處理，統計分析不同條件催芽處理后的種子萌發率、各項生理生化指標變化以及萌發相關基因的表達。結果表明，各因素單獨催芽處理，在適宜濃度范圍內均能促進種子萌發。而采用生長物質復配配方(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA 和 1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA)催芽處理，種子萌發迅速且各項生理生化指標顯著優于對照。此外，WRKY2基因的表達量在催芽處理后顯著提高。

烤煙；生長物質；種子萌發；生理生化指標

煙草種子是煙葉生產的重要基礎,種子活力的高低直接影響著煙葉產量和品質。然而種子的壽命具有一定的年限,由于在貯存過程中呼吸消耗強烈及萌發抑制物質的存在,導致發芽率和發芽勢大大降低,幼芽生活力弱,難以獲得壯苗。研究表明,播前催芽處理能明顯提高種子活力,使播種后出苗整齊,幼苗健壯[1]。目前生產上主要使用水[2]和赤霉素溶液[3]對煙草種子進行催芽處理。然而在種子萌發和幼苗生長過程中,除需要適宜的水分、溫度、光照和氧氣等外界條件外[4],植物生長調節物質如IBA[5]、6-BA[6]及大量元素[7]、微量元素[8]同樣起著相當重要的作用,尤其對幼苗的生理生化指標起到一定的調控作用。故開展有關營養元素與植物生長調節劑相結合進行種子催芽處理的研究尤為重要。

本研究采用不同濃度的 MS 營養液、GA3、IBA、6-BA 復配對煙草新、陳兩類種子進行催芽處理,不僅觀察種子萌發狀態和幼苗生長情況,而且對幼苗的生理生化指標及萌發相關基因的表達進行測定,目的是尋找提高種子活力的最佳催芽條件,探討提高陳種子發芽率的處理方案以及促進種子萌發的分子機理,為進一步提高煙草催芽種子質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為南方煙區主栽品種 K326 和北方煙區主栽品種 NC89 的新陳兩類種子。新種子為 2011年繁殖；陳種子為 2003 年繁殖,已存放 9 年,均由青島中煙種子有限責任公司提供。

1.2 催芽處理與播種

種子用 0.1%硫酸銅溶液消毒 10 min,蒸餾水沖洗 3 次,30 ℃晾干至含水量 10%左右,然后用配好的溶液浸種催芽。MS 營養液設 0、1/50 MS、1/20 MS 3 個梯度；GA3設 0、100、300 mg/L 3 個濃度梯度；IBA 和 6-BA 各設 0、0.2、2、10 mg/L 4 個濃度梯度；4 種因素完全隨機組合成 144 個處理,每個處理 3 次重復。催芽在光照培養箱內進行,12 h 光照/12 h 黑暗,溫度(27±1)℃,催芽 46 h[2]。催芽結束后,30 ℃晾干至含水量 7%左右[9],保存備用。設未處理和水處理兩個對照。

將培養皿內放入濕潤的脫脂棉墊,其上鋪一層濾紙。然后各處理挑選 300 粒種子,設置 3 次重復,每一重復播種 100粒種子。置于人工光照培養箱內,溫度為(27±1)℃,12 h 光照/12 h 黑暗。

1.3 生理生化指標測定及方法

點種后第 1～7 天,每天統計萌發種子的數量,繪制萌發曲線。將同一品種不同處理的種子在相同生長條件下播種 30 d 后,選擇某一株長勢較好的幼苗做標準,然后分別從不同處理中挑選長勢與其相似的煙苗 100 株,測定苗高、根長及苗鮮質量。參照參考文獻[10]的方法測定葉綠素含量、根系活力、過氧化物酶活性和硝酸還原酶活性。參照參考文獻[11]的方法測定不同處理種子浸提液電導率。

1.4 萌發相關基因 WRKY2 表達分析

分別提取催芽處理和未處理 NC89 新陳種子所育幼苗的總 RNA,按照 SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)的使用說明進行 qRT-PCR 反應。反應程序參照參考文獻[12]。每個樣品重復 3 次。所用引物根據 WRKY2(GenBank No. AF096299.1)和內參核糖體蛋白基因 NtL25 的 mRNA 序列利用Primer Premier 5.0 設計,WRKY2 特異引物(正向:5’-CCCACTATTACTTTACCACCGC-3’和 反 向 :5’-ATCTCTGGCGGAGGGGGAAAAC-3’)及 NtL25 引物(正向:5’-CAAAAGTTACATTCCACCG-3’和反向:5’-TTTCTTCGTCCCATCAGGC-3’)。反應完成后,用 ABI 7500 分析軟件對熒光定量結果進行分析,并構建相對定量表達圖。

2 結 果

2.1 不同濃度生長物質對烤煙種子萌發的影響

2.1.1 MS 營養液催芽處理對種子萌發的彯響 不同濃度 MS 營養液對 K326 新種子催芽后,播種第 2天,1/20 濃度處理種子的萌發率達到 74%,1/50 濃度和水處理種子的萌發率為 50%,而未處理種子尚未萌發。第 3 天,除未處理種子的萌發率為 70%外,其他均達到 90%左右。第 4 天,4 種處理的種子萌發率達到同一水平且趨于穩定(圖 1)。

2.1.2 GA3催芽處理對種子萌發的彯響 播種后第2 天,100 mg/L GA3處理種子的萌發率達到 94%,其他處理均在 50%以下(圖 2),說明此時 100 mg/LGA3對種子萌發的促進作用較強,高于此濃度,萌發率降低。但第 3 天,300、100 mg/L GA3處理種子的萌發率達到同一水平,且顯著優于對照。

圖2 GA3催芽處理對 K326 新種子萌發率的影響Fig. 2 Effects of priming by GA3on on germination rate of K326 new seeds

2.1.3 IBA 催芽處理對種子萌發的彯響 煙草種子經 0.2 mg/L IBA 處理后,第 2 天萌發率可達 78%；但隨著濃度增大,其促進作用逐漸減弱,2 mg/L IBA處理的種子在第 2 天萌發率為 57%,10 mg/L IBA的促進作用甚至低于水處理(圖 3)。表明 0.2～2 mg/L IBA 是促進烤煙種子萌發的適宜濃度范圍。

圖3 IBA 催芽處理對 K326 新種子萌發率的影響Fig. 3 Effects of priming by IBA on on germination rate of K326 new seeds

2.1.4 6-BA 催芽處理對種子萌發的彯響 烤煙種子經 0.2、2 mg/L 6-BA 處理后,第 2 天萌發率均達到 75%,但 10 mg/L 6-BA 的促進作用顯著低于水處理；第 4 天,2 mg/L 6-BA 處理種子的萌發率超過 0.2 mg/L 處理,且各處理的萌發率趨于穩定,經6-BA 處理種子的最終萌發率高于對照(圖 4)。

圖4 6-BA 催芽處理對 K326 新種子萌發率的影響Fig. 4 Effects of priming by 6-BA on on germination rate of K326 new seeds

2.1.5 不同生長物質復配處理對不同品種種子萌發的彯響 從 144 個處理組合中篩選出 3 種優異配方 A(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA)、B(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA)和 C(1/20 MS+300 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA),分別對 K326 和 NC89 新陳種子進行催芽處理,并對第2天萌發率進行方差分析(表1)。結果表明,3 種配方對 K326 和 NC89新種子的催芽效果無顯著差異,但與對照差異顯著(p＜0.05)；A 和 B 配方對 K326 和 NC89 陳種子的催芽效果無顯著差異,但顯著優于 C配方和對照(p＜0.05)；對 K326 和 NC89 種子的最佳催芽條件分別是配方B和A。

表1 不同生長物質復配處理對烤煙種子第 2天萌發率的影響Table 1 Effects of priming by the combination of different growth regulators on the second day germination rate of tobacco seeds

2.2 不同生長物質復配處理所引起的幼苗生理生化指標的變化

2.2.1 幼苗生長量的變化 營養配方 A 和 B 處理能顯著提高根系長度、煙苗高度和煙苗鮮質量,其中,根長均達 15.0 cm 以上,比對照增加 2.0 cm 之多(表2)。C 配方的促進作用較小,與水處理相似。同時,配方處理種子所育煙苗均伴有大量側根出現。

2.2.2 葉綠素含量的變化 不同處理所育煙苗的葉綠素含量方差分析結果顯示(表3),對于新種子,除C處理的NC89外,葉綠素含量均顯著高于對照(p＜0.05)；對于陳種子,A 配方處理的幼苗葉綠素含量顯著高于其他處理(p＜0.05)。

表2 不同生長物質復配處理對不同品種煙草幼苗生長素質的影響Table 2 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling growth

表3 不同生長物質復配處理對不同品種煙草幼苗葉綠素含量的影響 mg/gTable 3 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling chlorophyll content

2.2.3 TTC 法根系活力的變化 由表 4 看出,不同品種烤煙種子經A和 B配方處理所育煙苗的根系TTC還原強度較C配方和對照處理顯著提高,且 A配方顯著優于 B 配方(p＜0.05)。

表4 不同生長物質復配處理對不同品種煙草幼苗根系活力的影響 ug/(g·h)Table 4 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling root activity

2.2.4 過氧化物酶活性的變化 新種子經 A 配方處理所育煙苗的過氧化物酶活性顯著優于其他處理(p＜0.05),C 配方處理的效果甚至低于水處理；對于陳種子,A和B配方較好,且無顯著差異(表5)。

2.2.5 硝酸還原酶活性的變化 A 配方對 K326 新陳種子催芽處理后,所育煙苗的硝酸還原酶活性顯著高于其他處理(p＜0.05)；A 和 B 配方對于 NC89新陳種子的處理效果差異不顯著(表6)。

表5 不同生長物質復配處理對不同品種煙草幼苗過氧化物酶活性的影響 U/(min·gFW)Table 5 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling peroxidase activity

表6 不同生長物質復配處理對不同品種煙草幼苗硝酸還原酶的影響 ug/(gFW·h)Table 6 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling nitrate reductase activity

2.2.6 裸種浸提液電導率的變化 處理后的 NC89新陳種子浸提液電導率較對照顯著降低(p＜0.05),且 3 種配方間無顯著差異；對于 K326 新種子,A和 B 配方處理效果較好,而對于 K326 陳種子,C配方最好(表7)。

表7 不同生長物質復配處理對不同品種煙草種子浸提液電導率的影響 us/cmTable 7 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seed leaching solution conductivity

2.3 催芽處理對 WRKY2 基因表達的影響

NC89新種子經催芽處理所育煙苗中WRKY2的表達量分別是未處理的 2.2(A 配方)和 1.8(B 配方)倍；NC89陳種子經 A 配方處理后該基因的表達量是未處理的 2.7 倍(圖 5)。WRKY2 在未處理新種子中的表達量為陳種子的 3.4 倍。說明陳種子經長時間貯存后相關基因的表達活性明顯降低,而催芽處理能顯著提高種子萌發或代謝相關基因的表達量,這種作用在陳種子中更為明顯。

圖5 WRKY2 基因的熒光定量表達分析Fig. 5 qRT-PCR analysis of WRKY2注:1～3 分別為未處理、A 和 B 配方處理的 NC89 新種子；4、5 分別為未處理和 A配方處理的 NC89 陳種子。

3 討 論

前人對種子催芽的研究成果主要集中在對水和 GA3溶液最佳催芽濃度的研究上[13-16]。然而植物生長物質在種子萌發過程中也發揮非常重要的作用。故本研究將不同生長物質復配對烤煙新陳種子進行催芽處理,尋求最佳催芽條件,以提高烤煙催芽種子的質量,尤其是探討對陳種子具有一定修復作用的萌發條件。

本實驗采用不同濃度的 MS 營養液、GA3、IBA、6-BA 分別對烤煙種子進行催芽處理。結果表明,各因素在一定濃度范圍內均能明顯促進種子萌發。將 4 種因素復配成 144 個組合對不同品種烤煙的新陳兩類種子進行催芽處理,通過種子萌發率和生理生化指標評價,找到了兩種優異配方,其中對 K326和 NC89 種子進行催芽的最佳配方分別是 B 和 A。二者的唯一差別是 6-BA 的濃度不同,而單獨使用0.2、2 mg/L 6-BA 對種子萌發的促進作用沒有顯著差異,故推測這兩種催芽配方對種子萌發的促進作用沒有顯著差異,說明二者在兩個供試品種中具有通用性。然而該配方是否適用于其他品種以及經過配方催芽處理后種子所育煙苗移栽大田后的煙株長勢、煙葉產量和質量等方面的情況,需要進一步研究。

搭配組合催芽處理明顯優于各成分單獨使用時的效果。煙草種子經配方處理后,萌發迅速且發芽率高,主根長度明顯增加,一二級側根數目增加,幼苗生長健壯,避免了單獨GA3處理出現的高腳苗問題。催芽種所育煙苗葉綠素含量增加,具有較強的光合作用；根系活力明顯提高,根系發達,有利于營養物質的吸收和干物質的積累[17]；過氧化物酶活性提高,幼苗抗病性和抗逆性好[18]；硝酸還原酶活性提高,說明幼苗N代謝旺盛；裸種浸提液電導率大幅度降低,說明催芽處理后種子細胞膜完整性得到修復、活力提高[19]。

WRKY2 轉錄因子在植物生理代謝、形態建成和耐逆抗病等多種信號途徑中發揮重要調控作用。Jiang 等[20]發現,WRKY2 參與調控 ABA 依賴的種子萌發和萌發后的生長抑制。但其在煙草種子萌發中是否發揮作用,還未見相關報道。實驗中通過熒光定量表達分析證實催芽處理能夠顯著提高烤煙種子 WRKY2 基因的表達量。催芽處理的目的是解除種子休眠和促進萌發,故推測 WRKY2 可能與煙草種子萌發有關,其可能通過促進相關基因的表達,進而在一定程度上對種子尤其是陳種子的萌發能力進行修復,從而解除休眠、促進萌發或萌發后的生長發育。因此,本研究結果可實驗用于珍貴煙草陳種子的催芽,對其萌發能力進行修復,提高其發芽率。

4 結 論

篩選到兩個優異生長物質復配配方 A:1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA 和B:1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA,催芽效果顯著且在不同品種具有通用性；檢測到 WRKY2 基因在催芽后的表達量顯著提高,推測其與萌發能力的修復相關。

參考文獻

[1]陶嘉齡,鄭光華. 種子活力[M]. 北京:科學出版社, 1991:108-109.

[2]盧秀萍,白永富,肖炳光,等. 烤煙種子催芽時間與包衣后種子活力的關系[J]. 煙草科技,2004(2):41-43.

[3]劉啟彤. 赤霉素提高烤煙種子活力研究[D]. 長沙:湖南農業大學,2007.

[4]招啟柏,宋平,王廣志,等. 光、溫、激素對煙草種子萌發和幼苗生長的影響[J]. 中國煙草學報,2001,7 (4):29-32.

[5]李旭,王垠敦,張衛君. 不同 NAA、IAA、IBA 處理對苦瓜種子萌發的影響[J]. 廣東農業科學,2008(12): 47-48.

[6]張福平,賴秋純. 6-BA 等對番茄種子發芽與幼苗生長的影響[J]. 農業科技通訊,2008(6):36-38.

[7]汪鄧民,周冀衡,朱顯靈,等. K、Ca、Zn 離子對烤煙種 子 萌 發 及 幼 苗 抗 旱 性 的 影 響[J]. 中 國 煙 草 科 學, 1998,19(1):14-18.

[8]李章海,王能如,馮勇剛,等. 天然型脫落酸和微量元素對烤煙種子萌發的影響[J]. 煙草科技,2006(2): 53-55.

[9]劉啟彤,賴祿祥,黃一蘭,等. 烤煙催芽種子不同回干水分包衣對煙苗生長的影響[J]. 種子,2006,25(10): 76-77.

[10]劉家堯,劉新. 植物生理學實驗教程[M]. 北京:高等教育出版社,2010:13-15.

[11]劉思衡,曾漢章. 作物種子學[M]. 北京:科學技術出版社,2001:46-47.

[12]康 樂,張 麗 , 張 磊,等 . 普 通 煙 草 鈣 依 賴 蛋 白 激 酶NtCDPK15 的基因克隆及表達分析[J]. 中國煙草科學,2013,34(3):48-54.

[13]Ashraf M, Bray C M. DNA synthesis in osmoprmed leek (Allium Porrum L) seeds and evidence for repair and replication[J]. Seed Sci Res, 1993, 3∶ 15-23.

[14]Burgas R W, Powell A A. Evidence for repair proceses in the invigoration of seeds by hydration[J]. Ann Bot, 1984, 53(5)∶ 753-757.

[15]呂劍,喻景權. 植物生長素的作用機制[J]. 植物生理學通訊,2004,40(5):624-628.

[16]王忠. 植物生理學[M]. 北京:中國農業出版社,1999.

[17]曹宗巽. 根系在植物生活中的作用[J]. 生物學通報, 1959(10):487-492.

[18]張燕,方力. H2O2對提高煙草種子活力效應的研究[J].農業與技術,1997(4):42-44.

[19]鄭蔚虹,齊恒玉,何俊莉,等. 赤霉素對紫丁香種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 林業科技,2004,29(4): 4-6.

[20]Jiang W B, Yu D Q. Arabidopsis WRKY2 transcription factor mediates seed germination and postgermination arrest of development by abscisic acid[J]. BMC Plant Biology, 2009, 9∶ 96.

Effects of Several Growth Substance Combination Treatment on Priming of Flue-cured Tobacco Seeds

QU Xu1,2, DING Anming2, LIU Shaoyun1,2, LV Guoxin3, WANG Yongli3, XU Yongxing3, LI Yijun1,2*
(1. Qingdao Tobacco Seed Co., Ltd., Qingdao 266101, China; 2. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 3. Tobacco Company of Qingdao, Qingdao 266101, China)

s: To improve the quality of primed tobacco seeds, especially the germination ability of old seeds, studies were conducted on the seeds of K326 and NC89 of different years. The seeds were primed by different concentration of MS medium, GA3, IBA and 6-BA, and then the germination rate, physiological and biochemical indices and the expression of germination related gene were detected. The results showed that after priming treatment by proper concentration of each factor, the germination rate of flue-cured tobacco seeds were promoted, and the combination of different growth regulators (1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA and 1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA) had the best effects, After treatment of which the seeds geminated rapidly and each physiological and biochemical index was better than control significantly. What’s more, the expression level of WRKY2 was enhanced remarkably after priming treatment.

flue-cured tobacco; growth substances; seed germination; physiological and biochemical index

S572.041

1007-5119(2014)02-0020-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.004

屈 旭,男,碩士研究生,主要從事煙草種子生物學研究。E-mail:quxu1986@163.com。*通信作者,E-mail:zyseedli@tom.com

2013-07-24

2014-02-16