王 哲 ，譚曉風(fēng) ，龍洪旭 ，陳 昊

（中南林業(yè)科技大學(xué)a.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

油桐Vernicia fordii屬大戟科Euphorbiaceae油桐屬Vernicia，原產(chǎn)于中國，是我國特有的經(jīng)濟(jì)林木，與油茶、核桃、烏桕并稱為我國四大木本油料植物[1]。桐油是優(yōu)質(zhì)干性油，具有干燥快、光澤度高、附著力強(qiáng)、絕緣性能好、耐酸耐堿、防腐防銹等優(yōu)良性能[2]，是制造涂料和油漆的重要生產(chǎn)原料，也是制造生物柴油和改性高分子材料的優(yōu)質(zhì)原料。

油脂的合成是從乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A開始的[3]，丙二酰輔酶A是脂肪酸合成和脂酰鏈延伸系統(tǒng)等重要代謝的底物[4]，是脂肪酸合成中C2單位的供體，并且在脂肪酸氧化反應(yīng)中起到調(diào)節(jié)線粒體穿梭系統(tǒng)的作用[5]，乙酰輔酶A羧化酶被認(rèn)定為生物體內(nèi)的一個基本代謝底物和特定蛋白活性的調(diào)控因子[6]。所以，乙酰輔酶A羧化酶催化反應(yīng)不僅是第一和關(guān)鍵的步驟，同時也是限速步驟[7]。

ACCase在結(jié)構(gòu)上有3個功能域，分別是生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)、生物素羧基載體蛋白(biotin carboxyl carrier protein, BCCP)、羧基轉(zhuǎn)移酶(Carboxyl transferase, CT)。生物素以共價鍵連接在BCCP亞基上，在ACCase羧化乙酰CoA的過程中，其為羧基的中間載體。BC和CT各催化如下2個獨(dú)立的半反應(yīng)，BCCP則作為活化羧基的供體，在BC和CT之間擺動以傳遞羧基。

（1） BCCP＋ HCO3－＋Mg2＋－ATP→BCCP－CO2－＋Mg2＋－ADP＋Pi:Biotin carboxylase；

（2） BCCP－CO2－＋乙酰－CoA→BCCP＋丙二酰－CoA: Carboxyl transferase。

在自然界中，發(fā)現(xiàn)有異質(zhì)型和同質(zhì)型兩種在生理上有很大差別的ACCase形式[8]；而在植物體內(nèi)則有異質(zhì)型和同質(zhì)型兩種類型的ACCase，其分別位于質(zhì)體和胞質(zhì)溶膠中[9]。

異質(zhì)型ACCase，也稱為多亞基或原核型ACCase，存在于細(xì)菌及雙子葉植物和非禾本科單子葉植物的質(zhì)體中[10-11]。異質(zhì)型ACCase包含了4個亞基，即生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）、生物素羧基載體蛋白（biotin carboxyl carrier protein，BCCP）及羧基轉(zhuǎn)移酶（carboxyl transferase，CT）的 α-CT和 β-CT這2個亞基，其中前2個亞基組成BC和BCCP域，后2個亞基構(gòu)成CT催化域。在有活性的狀態(tài)下，異質(zhì)型ACCase的BC和BCCP亞基呈現(xiàn)同型二聚體，而α-CT和β-CT亞基呈現(xiàn)異型二聚體。異質(zhì)型ACCase不穩(wěn)定，容易解離。

同質(zhì)型ACCase，亦稱為多功能或真核型ACCase，存在于動物、酵母、藻類及植物的胞質(zhì)溶膠中，具有一個分子量為220～260 kDa的生物素包含亞基。這類單亞基ACCase含有3個功能域，在序列上對應(yīng)于異質(zhì)型ACCase的BC、BCCP、α-CT和β-CT組分，但與異質(zhì)型ACCase不同，同質(zhì)型ACCase的3個功能域融合成一條多肽鏈，結(jié)構(gòu)上更為穩(wěn)定而難以解離。不同生物來源的同質(zhì)型ACCase具有相同的組織結(jié)構(gòu)形式，即NH2-BCBCCP-CT-COOH。

ACCase與植物種子的含油量密切相關(guān)。Gengenbach等人[2]在以黃豆為材料的研究中發(fā)現(xiàn)，從發(fā)育早期到中期，高油黃豆ACCase的活性比低油黃豆高2倍。由此推斷，在種子的早期發(fā)育過程中，ACCase基因表達(dá)量的增加與種子成熟時含油總量的增加具有相關(guān)性。因此，在植物體內(nèi)過量表達(dá)的ACCase有可能導(dǎo)致植株和種子含油量的增加。Ohlrogge等人[12]將油菜種子貯藏蛋白napin特異性表達(dá)啟動子連接到擬南芥同質(zhì)型ACCase基因上，將其轉(zhuǎn)入油菜中，結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)基因植株T1代成熟種子的ACCase活性比對照增加了1.7～1.9倍，脂肪酸含量增加了6%，而T2代的脂肪酸含量則增加了5.0%～6.4%。Sellwood等人[13]利用反義表達(dá)技術(shù)抑制油菜同質(zhì)型ACCase的活性，結(jié)果獲得的轉(zhuǎn)基因植株其成熟種子的含油量顯著低于對照。油桐是我國特有的油料植物，開展乙酰輔酶A羧化酶質(zhì)體工程的研究，具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。因此，克隆與分析羧基轉(zhuǎn)移酶α亞基的cNDA基因是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用的油桐近成熟種子來自于湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)永順實(shí)驗(yàn)基地——國家油桐種質(zhì)資源保存庫。2012年8月底采集葡萄桐近成熟種子為實(shí)驗(yàn)材料，保存于－80 ℃的冰箱中以備用。

大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix 均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，PureLinkTM RNA Mini Kit購自英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司，高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase、100 bp 的 Plus DNA Ladder購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。無水乙醇、異丙醇等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油桐種子總RNA的提取和cDNA的合成

油桐種子總RNA的提取，參照英濰捷基生物技術(shù)有限公司的PureLinkTM RNA Mini Kit試劑盒中說明的方法進(jìn)行。以瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的提取效果。采用寶生物工程有限公司的cDNA合成試劑盒，參照試劑盒中的說明方法，得到第一鏈cDNA。

1.2.2 油桐ACCase基因α亞基的克隆

從油桐轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中獲得了α-CT亞基的全長序列，其開放閱讀框長為2313 bp。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計的上游引物（AF1）5'-ATGGCTTCTGTATCGCATTCTC-3 '和下游引物（AR1）5'-TAAATATCTAAGCAAAGCTGCGGTT-3'，以葡萄桐近成熟種子反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：5×Preme STAR Buffer（Mg2+）4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，上游、下游引物（10 μmol）各 0.4 μL，模板 cNDA 0.4 μL，Prime STAR HS 0.2 μL，dH2O 13 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60.2 ℃、30 s，72 ℃、150 s，30 個循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃Forever。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，再將回收產(chǎn)物與pEASYBlunt Simple載體連接起來，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，將其均勻地涂抹在含有氨芐青霉素的LB平板上，于37 ℃下培養(yǎng)8 h，挑取單菌落，37 ℃下?lián)u菌過夜。對菌液作PCR檢測，將陽性結(jié)果送至北京六合華大基因公司進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

用NCBI的BLAST功能（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索同源的核苷酸序列及氨基酸序列；用DNAman軟件將accA亞基與其它物種的氨基酸進(jìn)行比對，并用clustalx和MEGA4.0軟件構(gòu)建accA的系統(tǒng)進(jìn)化樹；用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）計算accA的分子量、等電點(diǎn)、分子式、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)；用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）檢測信號肽序列；用在線軟件protscale（http://expasy.org/tools/protscale.html） 分析accA的疏水性；用在線軟件TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測；用在線軟件SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；用ESyPred3D Web Server 1.0（http://webapps.fundp.ac.be/esypred/）預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因全長cDNA的克隆

以葡萄桐近成熟種子反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，用特異性引物（AF1、AR1）進(jìn)行擴(kuò)增，將回收的目的片段連接到pEASY-Blunt Simple上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，用PCR檢測后獲得了陽性克隆，最后進(jìn)行測序。最終確認(rèn)為：accA的cDNA序列全長為2 313 bp，其編碼770個氨基酸，命名為VfCTα，GenBank登錄號為KF964574。總RNA的電泳結(jié)果見圖1，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

圖1 總RNA的電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis result of total RNA

圖2 油桐accA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification result of accA gene in V. fordii

2.2 accA亞基序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 accA核苷酸序列分析結(jié)果

對accA的全長cDNA測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果與油桐轉(zhuǎn)錄組ACCase基因的accA亞基完全吻合，CDS長2 313 bp，其編碼770個氨基酸。將accA亞基CDS序列與NCBI中的 Blastn進(jìn)行比對，結(jié)果見表1。由表1可知，accA亞基核苷酸序列與麻瘋樹的相似度最高，達(dá)到90%，其與蓖麻、大葉楊、甜橙、葡萄、陸地棉等物種的相似度分別為88%、82%、80%、80%、78%。

表1 油桐accA全長cDNA序列的Blastn結(jié)果Table 1 Blast result of full-length cDNA of accA in Vernicia fordii

2.2.2 accA蛋白氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

運(yùn)用Primer5.0軟件將cDNA序列翻譯成氨基酸序列，結(jié)果得到了770個氨基酸。用DNAman軟件將accA蛋白的氨基酸與其它9個物種的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果如圖3所示。圖3表明：它與麻瘋樹的氨基酸同源性最高，可達(dá)90%，其次是蓖麻，為87%；它與可可、楊樹、陸地棉、葡萄、甜椒、番茄、黃瓜的同源性分別為76%、76%、72%、73%、69%、69%、68%。由圖3可知，不同物種accA亞基的相似性較高，N端的保守性很強(qiáng)，C端的保守性很弱。

圖3 油桐與其它物種的accA蛋白質(zhì)序列的比對結(jié)果Fig. 3 Alignment of accA protein sequences in V. fordii and other species

對這幾個氨基酸序列進(jìn)行深入的系統(tǒng)進(jìn)化分析，用clustalx和MEGA4.0軟件構(gòu)建accA亞基的進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，油桐與麻瘋樹最先聚合，然后與蓖麻聚合，再與葡萄、番茄甜椒聚合，而與可可、楊樹、陸地棉、黃瓜的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。在進(jìn)化樹上最先聚合的是親緣關(guān)系較近的物種，油桐與麻瘋樹、蓖麻同屬于大戟科，相對而言，其與上述其它物種的遺傳距離應(yīng)該也是最近的。

圖4 accA蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of accA protein

2.2.3 accA蛋白質(zhì)特性及親水性的預(yù)測結(jié)果

用在線軟件ProtParam對accA蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果（如圖4）表明：accA蛋白質(zhì)分子量為85 902.7 Da；其理論等電點(diǎn)為8.48，其中負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp＋Glu）數(shù)目為113，正電荷氨基酸殘基（Arg＋Lys）數(shù)目為118；其分子式可寫為C3798H6156N1044O1158S29；在280 nm下測定的光吸收值為0.403；該蛋白在大腸桿菌中的半衰期大于10 h；其不穩(wěn)定系數(shù)為37.33，被劃分為不穩(wěn)定蛋白；其脂肪系數(shù)為83.16。對提交于SignalP 4.1 Server網(wǎng)站的accA氨基酸序列進(jìn)行了信號肽預(yù)測，結(jié)果表明：accA中不存在信號肽切割位點(diǎn)，是一個非分泌蛋白。

用在線軟件protscale對accA進(jìn)行了親水性分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，其親水指數(shù)為－0.510。對親環(huán)素蛋白的疏水性也進(jìn)行了在線分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5還可知，該蛋白的疏水指數(shù)從－3.044 至2.589，約在第189、282位表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性，在第58、208、747、752位表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性。

圖5 油桐accA蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果Fig. 5 Analysis result of hydrophobicity of accA protein in V. fordii

2.2.4 accA亞基氨基酸跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測及功能域確定

將accA的氨基酸序列提交到Tmpred網(wǎng)站，對accA的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果如圖6所示。圖6表明：該蛋白有4個比較明顯的跨膜區(qū)，即第273～299、302～323位氨基酸的跨膜區(qū)，其跨膜方向由內(nèi)向外，另外兩個由外向內(nèi)的跨膜區(qū)位于第293～306和302～323位氨基酸。

采用同樣的方法，將accA氨基酸序列與SMART網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對，找出了相應(yīng)的功能結(jié)構(gòu)域。第92～236位氨基酸是ACCA功能域；第160～389位氨基酸為羧基轉(zhuǎn)移酶域。而第431～442、446～460、715～730、741～757位氨基酸則是復(fù)雜性弱的序列。

2.2.5 accA蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果

圖6 Tmpred對油桐accA跨膜區(qū)的預(yù)測結(jié)果Fig. 6 Tmpred prediction result of transmembrane domain in accA of V. fordii

在SOPMA網(wǎng)站預(yù)測的accA蛋白質(zhì)中，α螺旋結(jié)構(gòu)（438AA）占56.88%，延伸主鏈（69AA）占8.96%，β折疊（37AA）占4.81%，無規(guī)則卷曲（226）占29.35%。這一結(jié)果說明，accA基因編碼的蛋白質(zhì)主要以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，間或?yàn)闊o規(guī)則卷曲和延伸主鏈。

為了預(yù)測accA蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，必須先找到對應(yīng)模板。SWISS-Model是一個在已知大分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上的分子模建自動服務(wù)系統(tǒng)，用相似性在30%以上且結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)來建立未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子模型。在SWISS-MODEL中找到了金黃色釀膿葡萄球菌(編號為2f9iA)的accA蛋白，其與油桐accA蛋白的三級結(jié)構(gòu)最為相似，其中第89～406位氨基酸與2f9iA的相似度最高，相似度達(dá)到48%，故以此作為預(yù)測accA蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的模板。在ESyPred3D中提交accA氨基酸序列和參考模板（2f9iA），得到油桐accA蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（如圖7a）。從圖7a中可以看出，accA中有14個α螺旋。accA蛋白大致可以分為2個部分（如圖7b所示），一個是呈球體的主體，另一個是連接著主體的延伸部分，結(jié)合accA蛋白所起到的轉(zhuǎn)移羧基作用，此延伸部分應(yīng)該與accD蛋白結(jié)合形成CT功能域有關(guān)。

圖7 油桐accA蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型Fig. 7 Three-dimensional structure of accA protein in V. fordii

3 結(jié)論與討論

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）是催化種子脂肪酸生物合成的第一步，也是最關(guān)鍵的限速步驟。有關(guān)研究結(jié)果表明，ACCase的BC、BCCP、β-CT、α-CT亞基中任何一個亞基的基因超量表達(dá)均可提高種子的含油率[8,12,14-15]。植物體內(nèi)異質(zhì)型ACCase的BC、BCCP和α-CT三個亞基都是由核基因組編碼的，在N端都具有轉(zhuǎn)移肽序列，它們表達(dá)的前體蛋白被運(yùn)送到葉綠體中，除去轉(zhuǎn)移肽后，就組裝成了具有ACCase催化活性的高分子量的復(fù)合體[16]。在細(xì)胞質(zhì)中α-CT亞基所表達(dá)的前體蛋白被運(yùn)送到葉綠體中，與β-CT亞基所表達(dá)的蛋白結(jié)合，形成ACCase三大結(jié)構(gòu)功能域之一的羧基轉(zhuǎn)移酶（CT）。在不同物種accA蛋白氨基酸的多重比對中發(fā)現(xiàn)，所有accA所編碼的氨基酸都包含了ACCA功能域，該功能域位于accA保守區(qū)域內(nèi)，可以作為判斷accA亞基的標(biāo)志。而油桐accA亞基所編碼的氨基酸同樣含有ACCA功能域，位于第92～236位氨基酸。此次克隆的cDNA序列，通過網(wǎng)上比對，可確定為油桐ACCase的accA亞基，將其命名為VfCTα，并將accA亞基的核苷酸序列及其氨基酸序列登陸到GenBank，登錄號為KF964574。accA是組成乙酰輔酶A羧化酶4個亞基中的一個亞基，其本身并沒有活性，而且無法檢測其酶活性，在其體內(nèi)該酶與羧基轉(zhuǎn)移酶β亞基（accD）一起形成異源二聚體，即羧基轉(zhuǎn)移酶（CT），羧基轉(zhuǎn)移酶與生物素羧化酶（BC）和生物素羧基載體蛋白（BCCP）一起構(gòu)成乙酰輔酶A羧化酶這個多酶復(fù)合體，才能發(fā)揮該酶的作用。VfCTα的全長cDNA的確定，蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析和理化性質(zhì)分析及二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，為以后油桐ACCase基因的研究提供了理論依據(jù)，也為油桐accA亞基的表達(dá)及其對ACCase活性的影響提供了物質(zhì)條件，為油桐的分子育種奠定了基礎(chǔ)。

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