犬紅細胞抗原1.1血型多克隆抗體的制備與鑒定

杜國浩，李華濤，李守軍

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642）

犬的血型在1910年第一次被發現[1]。犬和人一樣有很多種血型，現在國際上公認的有8種血型，這些血型分別命名為犬紅細胞抗原1（DEA 1）、DEA 3、DEA 4等[2]。其中DEA 1有4個亞型：1.1、1.2、1.3和陰性[3]。學者認為DEA1血型為等位基因決定，DEA 1.1、1.2、1.3和陰性不會在犬上同時出現[4]。DEA1.1是在犬中最常見也是最重要的血型，有研究用蛋白質印跡方法檢測出DEA1.1為兩個膜蛋白，大小分別為50 kD和200 kD[5]。犬不含DEA1血型的天然抗體，首次輸血不會因血型不符發生嚴重的輸血反應，但再次輸血時，犬因血型錯配會發生輸血反應，嚴重時甚至致命，其中DEA 1.1的輸血反應最迅速也最劇烈[6-7]。因此，在輸血時應特別注意DEA1.1血型是否相配，DEA 1.1陽性受血犬可接受DEA 1.1陽性或陰性血液，DEA 1.1陰性受血犬可接受DEA 1.1陰性血液。

美國、澳大利亞等發達國家已有動物血庫，是以中央血庫的形式建立，并且有相應完善的血型檢測程序。國內沒有相應的動物血庫，在獸醫臨床上輸血也很少測血型，只是臨時找供血犬，輸血前進行簡單的交叉配血試驗，少數測血型也是依靠國外進口檢測試紙或者抗體，但進口試紙與抗體價值不菲，給國內獸醫臨床的輸血治療造成了巨大的阻力。本研究旨在制備DEA1.1血型多克隆抗血清，用于獸醫臨床寵物犬輸血前DEA1.1血型鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 QuickVet?/RapidVet Canine DEA1.1 Blood Typing Test，DEA 1.1，DEA3，DEA 4、DEA 7多抗，購自加利福尼亞國際動物血液資源庫；EDTANA2，抗犬IgG抗體，購自奧博森公司，木瓜蛋白酶，酶標抗犬IgG二抗，pH 7.2 PBS。

血型檢測及判定方法：嚴格按照快速檢測卡說明書操作：抽取全血直接檢測，結果與陰陽性對照比對。

抗球蛋白試驗法：2%紅細胞懸液與1∶200多抗100μL等體積混勻，放37℃溫箱中30min，再用pH 7.2 PBS洗滌兩次，離心棄上清，加1∶200抗犬IgG抗體100μL混勻，在37℃溫箱靜置30min，觀察結果。

酶處理法：2%木瓜蛋白酶的PBS與壓積紅細胞2∶1的比例混勻，放置37℃溫箱孵育30min，3 000 r/min離心5min，棄上清，加PBS洗滌，反復3次，取處理的壓積紅細胞與PBS配置成2%紅細胞懸液，用1∶200多抗與懸液100μL等體積混勻，37℃溫箱中靜置30min，觀察結果。

血凝試驗均用2 mL U型EP管進行，管底有塊狀沉淀著為凝集，均勻狀態者為不凝集，斜放觀察凝集為固定狀態，不凝集為流淌狀態。

1.2 試驗動物及樣本采集 經DEA1.1血型鑒定為強陽性本地犬提供紅細胞血型抗原，陰性的比格犬作為制備多抗的試驗犬。分別采集廣東本地犬30只，試驗用比格犬10只，多個品種寵物犬20只和藏獒犬8只抗凝血樣本。血液樣本3 000 r/min離心5 min，棄上清與白細胞層，加PBS洗滌3次，用PBS配置成2%紅細胞懸液，用于制備多抗符合率檢測。

1.3 多抗的制備

1.3.1 抗原制備與試驗動物的選擇 用血型檢測卡檢測篩選DEA1.1陰陽性犬用于試驗，并檢測DEA1.1，DEA3，DEA 4和DEA 7，排除其他血型干擾。無菌分離陽性血型犬紅細胞，pH 7.2 PBS制備成50%紅細胞懸液，作為抗原，陰性血型比格犬作為被免疫動物。

1.3.2 免疫程序 初免經靜脈、腹腔分別注射3mL抗原。14 d后二次免疫，抗原量同首免相同。以后每隔7 d用2mL抗原加強免疫，共免疫5次，最后1次免疫7 d后采血分離血清。

1.4 多抗的鑒定

1.4.1 陰陽性紅細胞鑒定 自制多抗用PBS稀釋100倍，分別用2%的DEA1.1陰陽性紅細胞做抗球蛋白試驗，觀察血凝結果。

1.4.2 血凝效價鑒定 自制多抗用PBS稀釋從100～2 000倍，間隔100倍，用2%的DEA1.1陽性紅細胞做抗球蛋白試驗，觀察結果，記錄血凝效價。

1.4.3 符合率統計 分別用200倍稀釋的進口DEA1.1多抗和自制多抗對采來的68只犬的紅細胞進行血型鑒定，兩組結果進行比對，得出自制多抗與進口多抗鑒定效果。

2 結果

2.1 抗原的確定 用快速檢測卡鑒定到并用于試驗的1只DEA 1.1陽性廣東本地犬和1只DEA 1.1陰性比格犬，如圖1，2。并用DEA 1.1，DEA3，DEA 4，DEA 7多抗對兩只犬的紅細胞分別進行抗球蛋白試驗，結果顯示DEA 1.1分別為陽性和陰性，其余血型除DEA4為陽性外，均為陰性，證明了進口多抗的有效性，并排除了其他血型的干擾。

圖1 DEA 1.1陰性犬血型

圖2 DEA 1.1陽性犬血型

2.2 多抗鑒定

2.2.1 抗球蛋白試驗結果 DEA 1.1陽性紅細胞陽性，DEA 1.1陰性紅細胞陰性。

本研究所制多抗與進口多抗符合率達98%。如表1。血凝效價試驗，鑒定結果顯示，血凝效價為1 800倍，約為211。

2.2.2 酶處理試驗結果 DEA 1.1陽性紅細胞陽性，DEA 1.1陰性紅細胞陽性。

采集的68份臨床樣本全部都是陽性。

3 討論

傳統的多抗制備方法[8]，運用原核表達或多肽合成法獲取抗原。本研究在抗原未知且不能純化的情況下，用DEA 1.1陽性紅細胞作為血型抗原，免疫同種DEA 1.1陰性犬，排除異種之間產生非特異抗體的可能。本研究用DEA 1.1進口多抗與自制多抗效果進行比對，發現在廣東地區68只犬中只有1只本地土狗結果不符合，并且這1只犬紅細胞用自制多抗檢測為陰性，而進口多抗檢測為陽性，這有可能因為自制的多抗比進口多抗對于DEA1.1抗原更加特異。抗球蛋白試驗顯示自制多抗與進口多抗的符合率高達98%。說明按照我們的方法制備的DEA1.1血型多克隆抗血清完全可以滿足臨床犬輸血前血型鑒定的要求，并且可以用于臨床輸血前的血型鑒定。

表1 DEA1.1血型符合率統計情況

有研究表明[9]，在某些病人的血清中存在某些抗體能凝集木瓜蛋白酶處理過的紅細胞，稱為唯酶抗體，該類抗體可凝集自身紅細胞，同型紅細胞及所有陰性紅細胞，致使酶處理過的紅細胞血型檢測結果不準確。本研究制作的多克隆抗體能與所有木瓜蛋白酶處理過的紅細胞反應。說明所制備的多克隆抗血清中含有唯酶抗體，原因未知。但是唯酶抗體僅僅對經過酶處理的紅細胞有反應，并不影響抗球蛋白試驗的結果，本研究制備的多抗可以有效的鑒定DEA1.1血型，但是需要注意的是不能鑒定用木瓜酶處理過的紅細胞。

本研究中調查顯示，廣東地區各品種犬的DEA 1.1血型陽性率有很大差異。值得注意的是廣東本地犬的DEA1.1陽性率高達83%，高于其他純種寵物犬。在國內獸醫臨床輸血中，多用本地的大中型本地犬為供血犬，這給臨床輸血治療帶來很大的風險。本研究還是首次對國內廣東地區本地犬的血型頻率進行調查，對于廣東本地犬的臨床輸血有很大的指導意義。

本研究成功制備了DEA 1.1血型多克隆抗體，經符合率比對后確定有效，并具有高血凝效價。DEA 1.1多克隆抗體的制備為國內犬血型檢測提供了保障，為DEA 1.1血型單克隆抗體的制備及進一步研究DEA 1.1抗原結構打下了良好的基礎。

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