豬組織中氟尼辛殘留量的HPLC測定方法試驗

陳 未，周偉偉，卜仕金

（1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州225300；2.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州225000）

氟尼辛（Flunixin）屬于非甾體類抗炎藥物（NSAIDs），主要通過抑制環氧化酶、減少前列腺素等炎性介質的生成而發揮解熱、鎮痛和抗炎作用，獸醫臨床應用廣泛、效果確鑿。目前，氟尼辛的相關制劑產品在國內獸醫臨床已批準使用，但針對動物源性食品中氟尼辛殘留量的檢測方法還鮮有報道。本試驗研究建立了豬肌肉、皮脂腎臟、肝臟4種組織中氟尼辛殘留檢測的HPLC檢測方法，為進一步加強動物源性食品中該藥物的殘留監控及消除規律研究提供了參考。、

1 試驗材料

1.1 儀器與設備 Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；R-210A型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；組織勻漿機B-400（瑞士Buchi公司）；CR22GⅡ高速冷凍離心機（Hitachi公司）等。

1.2 試劑與材料 乙腈，色譜純（德國Merck公司）；甲醇，色譜純（德國Merck公司）；磷酸，優級純（天津市科密歐化學試劑開發中心）；三乙胺，優級純（天津市科密歐化學試劑開發中心）；三氯乙酸，分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；PCX固相萃取小柱，300mg/6mL（美國Agilent公司）。

標準品：氟尼辛葡甲胺（flunixinmeglumine，FM），對照品：含量99%，批號81013，購自德國Augsburg公司。

2 試驗方法

2.1 試料制備與保存 取適量新鮮或解凍的未用藥空白豬組織（肌肉、肝臟、腎臟、皮膚及脂肪），絞碎并使均質。取均質后的供試樣品，作為供試試料；取均質后的空白樣品，作為空白試料；取均質后的空白樣品，添加適宜濃度的標準溶液，作為空白添加試料。-20℃以下貯存備用。

2.2 試液的配置：

2.2.1 氟尼辛標準儲備液（200μg/mL） 精確稱取氟尼辛葡甲胺標準品8.30mg，置于50mL容量瓶中，用80%甲醇水溶液定容至刻度，配制成濃度為200μg/mL的氟尼辛標準儲備液。-20℃以下保存，有效期6個月。

2.2.2 氟尼辛標準工作液（10μg/mL） 準確量取200μg/mL的氟尼辛的標準儲備液5 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用80%甲醇水溶液定容，配制成濃度為10μg/mL的氟尼辛標準工作液。4℃保存，有效期3個月。

2.3 樣品前處理 準確稱取均質后試料5（±0.05）g于50mL聚丙烯帶蓋離心管中，加入無水硫酸鈉5 g，再加15mL 1%TCA-乙腈溶液，高速渦動2min，5 000 r/min（10℃）離心5min，上清液入50mL聚丙烯帶蓋離心管中。下層殘渣用15mL提取液重復提取1次，合并上清液，向離心管中加入10mL乙腈飽和的正己烷，高速渦旋1min后5 000 r/min（4℃）離心5min，棄上層液體，下層入100mL雞心瓶，并加入5mL的正丙醇于45℃旋轉蒸發至近干。向蒸至近干的雞心瓶中加入3mL乙腈，渦旋振蕩3min，溶解殘渣后移至50mL聚丙烯帶蓋離心管中，加入9 mL 2%磷酸高速渦旋1min，4℃保存備用。采用PCX陽離子交換柱進行固相萃取，小柱依次用6mL甲醇活化、6mL水平衡，上樣后依次用6mL水、6mL甲醇淋洗，待小柱干燥后用6mL 10%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管內，60℃下氮氣吹干，殘留物用1.0mL流動相復溶，過0.22μm有機濾膜，濾液供檢測。

2.4 色譜條件 色譜柱：伊利特ODS-2色譜柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.05mol/L磷酸三乙胺溶液（60/40，v/v，pH=3.8）；波長：333 nm；流速：1mL/min；進樣量：80μL；柱溫：30℃。

2.5 標準曲線的繪制 準確吸取2.2.2配制的標準工作液適量，依次用流動相稀釋成5、2、1、0.5、0.1μg/mL和0.02μg/mL的標準工作液。在選定的色譜條件下，按濃度從低到高的順序分別進樣80μL作HPLC分析。每個濃度重復5次。以氟尼辛濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

2.6 檢測限與定量限測定 配制系列濃度氟尼辛標準工作液添加于空白試料（肌肉、腎臟、肝臟、皮膚及脂肪）中，制得相應組織藥物濃度，按2.3方法處理，重復5次，作HPLC測定。測得各樣品的峰高與噪音（基線峰高），取信噪比（S/N）≥3時的濃度為檢測限；結合準確性和精密度試驗，取信噪比（S/N）≥10時的濃度為定量限。

2.7 準確性測定 準確稱取空白試料，添加不同氟尼辛標準工作液，制得不同添加濃度的供測樣品。經2.3方法處理后，作HPLC測定；同時用對應濃度的氟尼辛標準液作HPLC測定。每一濃度分別重復5次。回收率的計算公式為：

式中：A為預處理后組織中氟尼辛的實測峰面積；As為對應標準液中氟尼辛的峰面積。

2.8 精密度測定 按2.7操作對各濃度樣品在同日內重復測定5次，測得氟尼辛峰面積，計算日內變異系數；在一周內不同日對4個濃度樣品進行5次重復測定，測得氟尼辛的峰面積，計算日間變異系數。

2.9 計算方法 試樣中氟尼辛的殘留量（mg/kg）

計算式：

式中：X-試料中氟尼辛的殘留量，mg/kg；C-試樣溶液中氟尼辛的濃度，mg/L；V1-復溶用流動相的總體積，mL；V2-過PCX固相萃取柱所用備用液體積，mL；V-定容用流動相的總體積，mL；M-試料的質量，g。

3 試驗結果

3.1 色譜行為 氟尼辛對照品、空白組織、藥物添加樣品色譜圖分別見圖1。

圖1 標準溶液色譜圖 （0.2μg/mL）

3.2 標準曲線和線性范圍 在建立的色譜條件下，用HPLC測定氟尼辛標準工作液中各個濃度，藥物濃度在0.02～5μg/mL范圍內，各濃度與其響應值呈良好的線性關系（R2≥0.999），得到標準曲線線性回歸方程。在建立的色譜條件下，氟尼辛的標準品平均濃度與其平均峰面積的回歸方程為：

y=72604x+949.99（R2=0.9998）

3.3 檢測限和定量限 根據5個空白樣品的基線噪音值求其平均值，取信噪比S/N≥3時氟尼辛的最低濃度，測得氟尼辛在肌肉、皮脂、腎臟、肝臟4種組織的最低檢測限分別為10、6、15、15μg/kg；根據精密度和準確度測定結果，取信噪比S/N≥3時氟尼辛的最低濃度，測得氟尼辛在肌肉、皮脂、腎臟、肝臟4種組織的最低定量限分別為25、10、30、30μg/kg。

3.4 添加回收率 豬肌肉在25、50、500μg/kg和1 000μg/kg4個添加濃度的平均回收率分別為83.66±3.97%、86.27±3.98%、82.76±5.37%、86.98±4.72%；豬皮膚及脂肪在10、20、500μg/kg和1 000 μg/kg 4個添加濃度水平的平均回收率分別為84.71±5.17%、86.62±4.11%、87.92±5.31%、90.69±4.32%；豬腎臟在30、60、500μg/kg和1 000μg/kg 4個添加濃度水平的平均回收率分別為79.55±5.33%、81.27±3.87%、84.56±7.27%、87.43±6.26%；豬肝臟在30、60、500μg/kg和1 000μg/kg 4個添加濃度水平的平均回收率分別為77.05±3.40%、78.98±5.50%、80.50±5.56%、78.49±3.06%。

3.5 精密度 豬肌肉、皮膚及脂肪、腎臟和肝臟中在3.4不同添加濃度的氟尼辛殘留精密度見表1。

表1 豬組織樣品精密度測定

4 討論

氟尼辛含有羧基和氨基，極性較大，在酸性條件下容易形成正離子。因此，利用酸性溶液提取，并利用陽離子交換柱進行凈化和富集就成了首選方法。豬組織中脂肪和蛋白質含量較高，如何除去脂肪和沉淀蛋白成為試驗的關鍵。三氯乙酸（TCA）是常用的酸性蛋白沉淀劑[1]，采用乙腈和TCA的混合提取液?？瞻滋砑釉囼灠l現，各組織中藥物回收率在71.9%～98.6%之間，色譜圖中雜質對于藥物響應干擾程度小，滿足檢測要求。當三氯乙酸的質量體積分數大于1%時將會影響藥物與交換柱之間的鍵合，故本試驗采用1%TCA-乙腈溶液作為提取液。

有研究發現[2]，C18柱對氟尼辛雖有較強的富集能力，但藥物難以洗脫，添加回收率在50%～60%范圍內，不能滿足檢測要求。SCX陽離子交換柱去雜質效果明顯，對肌肉和皮脂空白添加的氟尼辛富集效果較好，但對腎臟及肝臟空白添加氟尼辛富集效果不理想。本試驗最終選定Plexa PCX作為本檢測方法的固相萃取柱。此種萃取柱結合了優秀的表面親水性，并在聚合物基體的羥基化表面鍵合了磺?；?，孔內部為疏水特性，經過活化后具有獨特的極性梯度表面，從而有效降低離子抑制效應，離子交換機理可以去除樣品基質中的中性和酸性干擾物，對堿性分析物萃取濃縮，可以有效提高方法的靈敏度、定量和分析能力。

非甾體類藥物殘留檢測方法中大多采用C18色譜柱及反相高效液相色潽法，以有機溶劑/水溶液體系做流動相[3]。余祖功等[4]建立的血漿中氟尼辛殘含量測定高效液相色譜法，雜質峰對藥物峰有較大干擾，不適合本研究的藥物殘留檢測?？涤婪宓萚5-7]建立的超聲-波微波輔助提取-高效液相色譜法同時檢測羊肉組織中4種非甾體抗炎藥物殘留方法能夠將藥物峰與雜質峰分開，峰形較好，氟尼辛的響應值（峰面積）比較大。本研究基于上述試驗研究結果，經過優化，最終選擇甲醇-0.05mol/L磷酸三乙胺（60∶40 v/v,用三乙胺調節pH=3.8）作為流動相，流動相中加入三乙胺能消除色譜柱填料表面硅羥基的作用，改善氟尼辛的峰形，增大了靈敏度，pH=3.8有利于色譜柱對藥物的分離作用[8]。

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