龍巖市仔豬病毒性腹瀉檢測與分析

鄭新添，吳天興，戴愛玲，李曉華，楊小燕

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖364012；2.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖364012）

腹瀉是危害豬場最嚴(yán)重的疾病之一，尤以仔豬 腹瀉發(fā)病更為嚴(yán)重。腹瀉的病因有多種，其中傳染病是一個(gè)主要因素，引起仔豬腹瀉的傳染病中，危害最大的是豬傳染性胃腸炎（TGE），豬流行性腹瀉（PED）及豬輪狀病毒（RV）感染等病毒性腹瀉。TGE是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，發(fā)病急，傳播快，各種年齡的豬都可感染，以引起7～10日齡仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和高死亡率為特征。PED是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的高度接觸性胃腸傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬高度死亡為特征。豬輪狀病毒是人畜共患腹瀉的重要病原之一，也是仔豬腹瀉的重要病因。TGE、PED和RV在臨床癥狀、流行病學(xué)和病理變化上無明顯差異，目前尚無特效治療藥物，給豬場造成了很大損失[1]。近年來，仔豬這3種病毒性感染發(fā)病率呈上升趨勢，流行病學(xué)規(guī)律發(fā)生較大變化，如病毒的混合感染日趨增多[2]。為了解龍巖市豬場病毒性感染情況，本文在前期建立多重RT-PCR鑒別診斷TGEV、PEDV以及RV感染的基礎(chǔ)上[3]，對龍巖市近兩年仔豬的TGE、PED及RV病毒性腹瀉進(jìn)行檢測與分析，為該病的預(yù)防、控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 96份病料采集自2012年1月至2013年9月龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所接診的45個(gè)豬場的腹瀉糞便及小腸、淋巴結(jié)等組織。

1.1.2主要試劑與引物 TRIZol、RNA反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker DL-2 000等，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其他試劑均為分析純。3對擴(kuò)增引物分別是TGEV（tgev-f 5′-CAACCCTGAAACTAACGCAATTCT-3′，tgev-r 5′GCCCATCCAGTCGCACTAC TT-3′）、PEDV（pedv-f 5′-AGGAACGTGACCTYAAA GACATCCC-3′，pedv-r 5′-CCAGGATAAGCCGGTC TAACATTG-3′），RV（RV-f5′-AAATCCGCAACTAT ACTGTGACTA-3′，RV-r 5′-TGGCCAACTGGTTCTGTCTA-3′）引物擴(kuò)增長度分別為252 bp，540 bp和410 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取及逆轉(zhuǎn)錄 RNA提取采用TRIZol試劑提取法。稱取組織0.2 g（糞樣預(yù)處理：取0.2 g，加入0.8mLPBS振蕩混勻，10 000 r/m離心10min，取200μL上清），加入TRIZol Reagent600μL，室溫作用5min后加入200μL氯仿，顛倒混勻。4℃，12 000 r/min離心10min，取上清至新的1.5mL離心管中，加等體積異丙醇，顛倒混勻。12 000 r/min（4℃）離心10min，棄上清，1mL 75%乙醇洗滌。12 000 r/min（4℃）離心10min，自然干燥，用20μLDEPC水溶解。逆轉(zhuǎn)錄過程為：在1.5mL離心管中加入：MMuLV 5×Buffer 4μL，Rnase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase（5 U/μL）1μL，random primer 1μL，dNTPs（2.5mmol/L）1μL，RNA模板5μL，室溫下混勻后，42℃水浴1 h，冰浴2min，10 000 r/min離心30 s，即得cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 腹瀉病毒PCR檢測 用本實(shí)驗(yàn)室建立的多重RT-PCR法進(jìn)行TGEV、PEDV和RV的病原檢測[3]。以上述步驟1.2.1中合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）1μL，TGEV、PEDV和RV等3對引物各1μL，rTaq（5 U/μL）0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 16.5μL。95℃預(yù)變性5min后，進(jìn)入95℃60 s，51℃和72℃60 s，共循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。4℃保存PCR產(chǎn)物。PCR結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 TGEV、PEDV及RV的檢出率 對96份腹瀉病料進(jìn)行TGEV、PEDV和RV病原檢測，部分檢測結(jié)果如圖1，結(jié)果表明（表1），TGEV、PEDV和RV陽性率分別為25.0%（24/96）、22.9%（22/96）和14.6%（14/96）；TGEV+PEDV、PEDV+RV及TGEV+RV混合感染陽性率分別為5.2%（5/96），7.3%（7/96）和4.2%（4/96），3者混合感染陽性率為2.1%（2/96）。

圖1 部分樣品PCR檢測結(jié)果

表1 龍巖市TGEV、PEDV及RV感染情況

2.2 TGEV、PEDV及RV感染的月份分布 對所調(diào)查的96份樣品，按其送檢月份分成12-2月、3-5月、6-8月及9-11月，統(tǒng)計(jì)各階段的感染率（表2），結(jié)果表明，TGEV在12-2月份陽性率（45.9%）較高，PEDV在3-5月份陽性率高達(dá)32.4%，RV不具有明顯的季節(jié)性，除12-2月份未發(fā)現(xiàn)感染外，其他月份的陽性率相近。

表2 不同月份的陽性率分布

2.3 TGEV、PEDV及RV感染豬的年齡分布 對所調(diào)查的96份樣品，送檢豬按年齡分為1-4周齡和5-12周齡兩類，統(tǒng)計(jì)兩個(gè)階段病毒性腹瀉的陽性率，結(jié)果表明（表3），1-4周齡共71份樣品，TGEV、PEDV和RV的陽性率分別為23.9%，22.5%和14.1%；5-12周齡共25份樣品，TGEV、PEDV和RV的陽性率分別為28%，24%和16%。

表3 不同周齡的陽性率分布

3 討論

TGEV、PEDV及RV是仔豬病毒性腹瀉的3種主要病原，3者導(dǎo)致的仔豬病毒性腹瀉臨床上難以區(qū)分，RT-PCR技術(shù)可對其進(jìn)行敏感、特異的鑒別。筆者建立的可同時(shí)鑒別此3種病毒的多重RT-PCR技術(shù)為本次感染率調(diào)查的準(zhǔn)確性提供了保證[3]。仔豬的此3種病毒性在不同地區(qū)的感染率不同，近兩年國內(nèi)報(bào)道的PEDV感染率較高[4-5]，陽性率甚至高達(dá)87.9%[6]，此次調(diào)查表明，我市的PED感染率相對較低，但陽性場比例仍然較高。96份糞便檢測結(jié)果表明，TGEV、PEDV及RV陽性率分別為25.0%、22.9%和14.6%，因此筆者認(rèn)為2012-2013年9月龍巖市以豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎為主，而輪狀病毒感染率較低。此3種病毒間常呈單獨(dú)感染或混合感染，近年來混合感染在我國豬場呈上升趨勢[7-8]。此次檢測表明，本市豬場TGEV和PEDV混合感染、PEDV和RV混合感染、TGEV和RV混合感染陽性率分別為5.2%（5/95）、7.3%（7/96）和4.2%（4/96），3者混合感染率為2.1%（2/96），其混合感染率與其他報(bào)道相近[8]。TGE，PED和RV等仔豬病毒性腹瀉多發(fā)生于冬春和晚秋季節(jié)，近年來，在很多地區(qū)和規(guī)模化豬場，夏秋季也有豬病毒性腹瀉的流行[9]。本文通過對小豬感染月份的統(tǒng)計(jì)和分析表明，龍巖市TGEV在12-2月份陽性率高達(dá)50%，PEDV在3-5月份陽性率高達(dá)32.4%。PEDV在我國以12月至次年2月為高發(fā)季節(jié)[10]，而此次檢測表明，PEDV的季節(jié)性有不明顯趨勢，這與國內(nèi)對兩種疾病的流行報(bào)道相近[11]。仔豬腹瀉性疾病主要發(fā)生在出生后10日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，日齡較大的哺乳仔豬的發(fā)病率和病死率相對較低。本文研究表明，日齡較大的5-12周齡仔豬感染率有上升趨勢。病毒性腹瀉尚無有效治療藥物，疫苗免疫接種是預(yù)防豬病毒性腹瀉的主要手段，應(yīng)在制定免疫程序時(shí)加強(qiáng)母豬免疫，同時(shí)加強(qiáng)豬場中小豬階段的保溫和衛(wèi)生管理，定期消毒。

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