兩株豬博卡病毒的檢測及遺傳演化分析

周 宇，唐連飛，朱事康，朱中武，佟鐵鑄，禹思宇，劉 星，陳燕忠，鄒東輝，羅卓軍

（1.惠州出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東 惠州516006；2.湖南出入境檢驗檢疫局，湖南，長沙410004）

豬博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）屬于細小病毒科、博卡病毒屬，為單股線狀無囊膜DNA病毒，基因組在5.2 kb左右[1]，包括3個開放閱讀框（ORFs），分別編碼非結構蛋白NS1，結構蛋白VP1/VP2和磷酸化的非結構蛋白NP1[2-3]，NP1基因的功能尚不清楚，VP1/VP2基因是其主要的抗原基因。該病毒的理化性質、致病機理和能引起的臨床癥狀尚不清楚，對該病毒的研究仍處于起步階段。2009年，瑞典科學人員首先發現了世界上第一例豬博卡病毒[4]，2010年，翟少倫等[5]首次在我國191份疑似患高熱病的病料中檢出PBoV，胡軍勇等[10]在對豬腹瀉樣品進行檢測時發現PBoV的陽性率達到69.35%，表明該病毒在發生腹瀉的豬腸道內普遍存在，雖然該病的致病性仍然存有爭議，但其經常會與豬圓環病毒2型、豬輸血傳染病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等在豬體內同時被檢出。此后在中國北京市、上海市、湖北省等相繼檢測到豬博卡病毒。2010年Shan等[9]在無臨床癥狀的豬糞便樣品中檢測到PBoV的廣泛存在，2011年張志等[6]從河南某豬場表觀健康豬樣品中檢測到PBoV，表明我國內地已經存在豬博卡病毒的感染。在基因分型上，翟少倫[7]等將其分為4個基因型，郝飛等[8]將其暫時分為7個基因型，國際病毒學分類委員會關于博卡病毒的分類方法按照非結構蛋白編碼區NS1基因進行分類，但也有學者提出人博卡病毒應按照結構蛋白編碼區VP1/VP2基因進行分類。其基因分型還需要進一步完善。

1 材料與方法

1.1 樣品 200份豬糞便樣本，分別采集自廣東粵東地區的豬群。用1mL PBS稀釋震蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，取200μL上清液進行病毒DNA抽提（采用天根生化科技（北京）有限公司的病毒DNA提取試劑盒）。

1.2 引物設計與合成 參照GenBank發表的豬博卡病毒序列，登錄號為：HQ223038和HM053693，使用Primer5.0引物設計軟件，分別針對NS1、NP1、VP1/VP2基因設計引物（如表1所示）。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。-20℃保存備用。

表1 豬博卡病毒不同基因的PCR引物

1.3 PCR擴增 PCR反應體系為25μL，反應體系中含：上游引物、下游引物各2.5μL，2*Mix 12.5μL，模板2.0μL，ddH2O 5.5μL。PCR擴增條件為：NP1：95℃5min；94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個循環；72℃10 min；NS1和VP1/VP2：95℃5 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃90 s，35個循環；72℃10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.4 測序和分析 將陽性PCR產物送交英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序，然后將序列進行BLAST分析，并用DNAStar，MEGA5.1軟件進行比對和進化樹分析。參考序列選擇了自2010-2013年已公布的豬博卡病毒全基因序列。登錄號分別為：HQ223038，HM053693，HM053694，HM053672，HM053673，HM031134，JN831651，HQ291308，HQ29 1309，JF429834，JF429835，JF429836，JF512472，JF5 12473，JF713715，JF713714，JX854557，KC473563，KF206165，KF206155，KF206157，KF206167。

2 結果

2.1 PCR擴增 利用引物對所有樣品進行PCR擴增，有2份樣品可以擴增出特異性條帶（見圖1，圖2，圖3），將兩份樣品分別命名為GD4和GD18。

2.2 遺傳分析

2.2.1 同源性比較 對GD4株和GD18株的NS1基因、NP1基因、VP1/VP2基因分別進行測序，測得的片段長度與預期的目的片段長度一致。應用BLAST和DNAStar分析軟件進行相關全基因序列進行同源性比較，發現GD4株和GD18株相關基因同源性較低，在34.9%～50.5%之間。GD4株與HQ223038、JX854557、HQ291308相關基因的同源性較高，96%～99.8%之間，與其他毒株同源性較低，在60%以下；GD18株與KF206167、HM053693、HM053694、HQ29 1309、KF206165、KF206155同源性較高，在89.6%～96%之間，與其他分離株的同源性較低，在60%以下。兩個毒株屬于不同的基因型，GD4株基因突變率較低，GD18株基因突變率較高。

圖1 NS1基因的檢測結果

圖2 VP1/VP2基因的檢測結果

圖3 NP1基因的檢測結果

2.2.2 氨基酸系統進化樹分析 應用MEGA5.1分析軟件分別對GD4株和GD18株的NS1、NP1、VP1/VP2基因編碼的氨基酸序列與參考株進行比對，繪制系統進化樹，發現只有HM031134（中國江蘇）株處于1個較遠的分支。其他豬博卡病毒分為2個大分支，3個小分支，GD4株和GD18株的NS1和NP1處于1個大分支，不同的次分支，與多個歐洲株具有共同的祖先，在進化的過程中出現分化；而與美國、香港株親緣關系較遠；VP1/VP2卻處于不同的大分支上。尤其是GD4株的VP1/VP2明顯的處于1個獨立的分支，預示其有自己獨立的遺傳演化趨勢（見圖4，圖5，圖6）。

3 討論

圖4 NS1氨基酸系統進化樹分析

圖5 NP1氨基酸系統進化樹

圖6 VP1/VP2氨基酸系統進化樹

當前對PBoV的研究還處于初級階段，主要研究病毒的形態和基因組情況，并建立了相關的檢測方法。本研究摘錄了NCBI公布的PBoV具有代表性的全部22條PBoV的全基因序列。通過核苷酸序列的同源性比較和進化樹分析發現，HM031134株與其他PBoV株的同源性很低，同源性在5.0%以內，而且在進化分支上相距較遠并處于獨立分支。而PBoV的各不同分離株大體可分為3大分支，并且同一分支序列的相似性較高，同源性在80.0%以上，變異性較低，而在不同分支之間的核苷酸序列相似性較低；地域性差異并不大，如美洲、歐洲、亞洲、非洲的毒株處于同一個進化分支；從目前公布的序列發現，國內存在的PBoV存在多樣性和在一個地區同時存在多個毒株的情況，如上海的兩個毒株HQ291308和HQ291309之間的差異顯著；河南株與香港、美國等某些毒株同源性較高，而與其他國內毒株同源性較低，距離較遠。本研究所得的兩個毒株之間具有明顯差異，分屬不同的基因型，并且兩個毒株均與歐洲株親緣關系較近，與美國、香港毒株關系較遠，推測認為是由于豬的引種和貿易往來導致的；氨基酸系統進化樹表明GD4株的VP1/VP2處于獨立的分支而其他兩個基因編碼的氨基酸卻在同一大分支上，懷疑該毒株可能存在基因重組的可能，并且該毒株與其他毒株的致病性可能不同。雖然已經證實多種博卡病毒能夠感染并且導致宿主發生急性腹瀉[11-12]，并且該病毒在發病豬群中的檢出率明顯高于健康豬群的檢出率，但對于豬博卡病毒是否能導致宿主腹瀉仍然存有爭議[13-14]，需要進一步深入研究。

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