1株禽源豬流感H 6N 6病毒的反向遺傳系統的建立

譚力凱，張民澤，邵振文，曹 楠，粟 碩，陳濟鐺，周 晗，張桂紅

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642）

A型流感病毒是能夠感染禽類、豬、馬、犬類、水生哺乳動物及人類等宿主的重要病原體[1-2]。至今為止，已在A型流感病毒的自然宿主上分離出17種血凝素抗原(HA)和10種神經氨酸酶抗原(NA)，除H17N10外的病毒亞型均已從禽類宿主中分離到[1-3]。此外，從其他宿主中分離到的流感病毒也常常來源于禽流感的跨宿主傳播[1]。1997年在香港暴發的H5N1禽流感導致了18名病患死亡，警示了我們關于禽流感跨宿主傳播的潛在風險[4]。

H6亞型流感病毒于1965年首次在火雞中分離，時至今日，H6亞型流感病毒已經成為了分離頻率最高的禽流感病毒之一[5-8]。在華南地區，H6亞型流感病毒是在番鴨中最為普遍的流感病毒[9-10]。值得注意的是，養禽業中的H6亞型流感病毒有可能已經獲得了偶發性跨宿主傳播感染哺乳動物的能力。根據在中國和美國進行的血清學調查結果顯示，H6亞型禽流感病毒或許已經感染過人類[11-12]。2010年在中國華南地區分離到的類禽型豬流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）是世界上首例從哺乳動物上分離到H6亞型流感病毒的報道，其8個片段全部來源于水禽源H6亞型禽流感病毒[9-13]。為了更好地防控流感病毒對養殖業和公共衛生方面的威脅，對其傳播機理和致病機理進行研究顯得尤為重要。

反向遺傳技術的出現使得從分子水平研究流感病毒致病性、種間傳播能力、病毒變異機制更為方便與直觀[14-15]。本試驗利用反向遺傳操作技術首次建立了禽源H6亞型豬流感病毒8質粒反向遺傳系統，為進一步研究該病毒的基因功能、致病機理和傳播機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株和主要試驗材料 豬流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）（簡稱GDK6）由本實驗室分離保存[13]；反向遺傳雙向表達載體pHW2000由密西西比州立大學萬秀峰助理教授饋贈；感受態細胞E.coli DH-5α由本實驗室自行制備；293T細胞和MDCK細胞由本實驗室自行保存；9日齡SPF雞胚由北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司提供；6周齡Balb/C小鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 病毒RNA抽提試劑盒，購自上海華舜生物公司；反轉錄酶MLV、RNA酶抑制劑（Ribo?nuclease Inhibitorv）、dNTPMixture（2.5and 10 mmoleach）、DNAMarker DL-2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產品；高保真酶PfuUltraⅡFusion Hs DNA Polymerase，購自Agilent公司；限制性內切酶Aar I、Bsa I、BsmB I及T4連接酶，均購自Thermo Scientific公司；轉染試劑Lipofectamine?LTX，購自Life Technologies公司；PCR產物純化回收試劑盒，購自Promega公司；中量質粒抽提試劑盒，購自Qiagen公司。

1.3 引物設計與合成 反轉錄(RT)通用引物為Uni-12（5'-AGCRAAAGCAGG-3'），根據參考文獻[16]與GDK6病毒序列設計流感病毒基因組Segment1～8的PCR引物，由Life Technologies公司合成。

1.4 病毒RNA抽提及片段擴增 根據病毒RNA抽提試劑盒說明書從分離保存的雞胚尿囊液中抽提病毒RNA，使用MLV反轉錄酶反轉錄獲得病毒cDNA；以cDNA為模板使用PfuUltraⅡFusion Hs DNA Polymerase對流感病毒的8個片段進行PCR擴增。PCR產物經電泳后使用PCR產物純化回收試劑盒進行切膠回收。

1.5 重組質粒的構建 PCR純化回收產物使用相應限制性內切酶進行酶切，純化后將DNA片段克隆至經酶切的pHW2000載體中。重組質粒轉化至感受態細胞后挑單菌落送至Life Technologies公司測序，測序正確的菌株擴大培養并提取質粒。

1.6 細胞轉染與病毒拯救 按照Lipofectamine?LTX轉染試劑說明書進行操作，將8個重組質粒按每個0.25μg的比例與6μL轉染試劑混合于300μL的opti-MEM培養基中，作用30min后共轉染于6孔板中293T細胞形成的90%細胞單層中。轉染后2 h往培養液中加入終濃度為1μg/mL的TPCK胰酶（Sigma公司）。37℃、5%CO2條件下培養48 h后收集細胞上清并接種于MDCK細胞上，培養液中加入0.5%BSA（Sigma公司）和終濃度為1μg/mL的TPCK胰酶，37℃、5%CO2條件下培養48 h后收集細胞培養液并測定其血凝效價（HA）。拯救病毒簡稱為rGDK6。

1.7 救獲病毒的鑒定 將救獲病毒進行血凝抑制試驗（HI）以確定其HA亞型；將救獲毒株在SPF雞胚上連續傳代3代后使用病毒RNA抽提試劑盒抽提救獲病毒RNA，使用MLV反轉錄酶反轉錄獲得病毒cDNA，以cDNA為模板擴增病毒M片段中較保守的一段，送Life Technologies公司測序，與親本毒株相應序列比較序列結果。

1.8 救獲病毒與親本病毒組織培養半數感染量（TCID50）比較 GDK6與rGDK6病毒分別以1∶103～1∶1010的8個稀釋度接種于MDCK細胞上進行TCID50試驗，每個稀釋度8個重復，以世界衛生組織的規定計算TCID50。

1.9 救獲病毒與親本病毒對小鼠致病性比較

將GDK6與rGDK6病毒分別以106TCID50經鼻腔途徑接種6周齡Balb/C小鼠，每組8只，連續觀察2周，每天記錄體重變化情況，攻毒后72 h隨機安樂死3只小鼠，取心、腦、脾、肺、腎接種9日齡SPF雞胚，72 h后通過HA試驗檢測病毒。

2 結果

2.1 病毒基因組各片段擴增及重組質粒構建

從分離保存的雞胚尿囊液中提取病毒RNA，反轉錄得到cDNA后分別用8對帶酶切位點的特異性引物擴增流感病毒的8個基因片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到的HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2這8個基因片段與理論值相符。擴增結果如圖1。將PCR產物純化回收后用相應限制性內切酶酶切，酶切產物連接至pHW2000載體上，將連接產物轉化至感受態細胞E.coli DH-5α中，挑單克隆菌株進行測序，測序結果證明重組質粒構建成功。

圖1 GDK6株基因組各片段的RT-PCR擴增

2.2 救獲病毒的鑒定 將轉染后48 h的細胞上清接種于MDCK細胞上，48 h后收集細胞上清，經HA試驗鑒定有血凝，經HI試驗鑒定為H6亞型，與親本毒抗原性一致。提取病毒RNA進行RTPCR后。將PCR產物進行測序鑒定，測序結果表明救獲病毒核酸序列與親本病毒相應序列完全一致。將救獲病毒命名為rGDK6。

2.3 救獲病毒與親本病毒生物學特性比較 根據Reed-Muench法算得rGDK6毒株的TCID50為106.88/mL，與GDK6毒株相一致。

2.4 救獲病毒與親本病毒對小鼠致病性比較

rGDK6毒株與GDK6毒株以106TCID50劑量感染Balb/C小鼠后小鼠體重都有輕微下降，而對照組體重則持續上升（圖2）。感染后48 h可觀察到小鼠被毛豎立，食欲與精神狀態均正常。對小鼠各臟器進行病毒檢測結果表明，rGDK6毒株與GDK6毒株均只能感染肺組織，在其他臟器里均檢測不到病毒。由此可見，救獲病毒與親本病毒對小鼠的致病性及組織嗜性基本一致。

圖2 病毒感染后的小鼠體重變化

3 討論

豬既能感染禽流感，也能感染人流感，因而是流感病毒重要的中間宿主，被稱為流感病毒的“生物混合器”。禽流感病毒感染豬后既有可能與人流感病毒發生基因重組產生新的易感染人類的毒株，也有可能通過在豬群間傳播從而產生適應哺乳動物的毒株[17]。因而對禽源豬流感病毒進行致病機理和傳播機理的研究具有重要的公共衛生學意義。

本研究中采用的GDK6毒株是8個片段全部源于水禽源禽流感的豬流感病毒，是世界上首例H6亞型流感病毒感染哺乳動物的報道。GDK6毒株的HA基因屬于Group II譜系，該譜系的病毒至今仍在中國華南地區的水禽養殖業中廣泛傳播，是華南地區水禽養殖業中流感病毒的優勢流行株[9-13]。因此需要進一步對該病毒進行研究其有無在哺乳動物間傳播及對哺乳動物致病的能力。

至今為止，關于H6亞型流感病毒的反向遺傳系統和禽源豬流感的反向遺傳系統均少有報道，本研究建立起了GDK6毒株的反向遺傳系統，并成功拯救出了病毒。通過HI試驗、病毒基因組測序、TCID50試驗和小鼠攻毒試驗表明，救獲毒株的生物學特性和對小鼠的致病性與親本病毒一致。目前，關于該病毒的傳播機理和對哺乳動物的致病機理的研究依然處于空白，H6亞型流感病毒能否通過與其他亞型病毒基因重組或通過基因突變而產生能在哺乳動物中造成流行的毒株依然未知。GDK6反向遺傳系統的建立為以后的研究開拓了道路，利用該系統可深入研究H6亞型流感病毒對哺乳動物的致病能力和傳播能力的關鍵基因及位點，探索其復制調控機制、變異方向、致病性、種間傳播分子機制，為預測流感病毒大流行提供依據，也為新型流感基因工程疫苗的研發提供了技術儲備。

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