種鴨源豬丹毒絲菌分離及血清學(xué)調(diào)查

王 騰，靳 換，紀(jì)麗麗，張清水，韓相敏，孫海港，白如念，楊秀環(huán)，何偉勇，蘇敬良

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀100193；2.北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京 朝陽100107）

豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）是一種兼性厭氧的革蘭陽性小桿菌，作為多種家養(yǎng)和野生動(dòng)物的病原菌或共生菌廣泛存在于自然界，包括海洋環(huán)境中，與扁桃體丹毒絲菌（E.tonsillarum）和E.inopinata共同構(gòu)成丹毒絲菌屬[1]。根據(jù)目前的血清學(xué)分型方法，采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可將該屬成員可分為至少23個(gè)血清型（serovar 1-23）及N型株，其中豬丹毒絲菌包括血清型1a、1b、2、4、5、6、8、9、11、12、15、16、17、19、21型和N型；扁桃體丹毒絲菌包括血清型3、7、10、14、20、22型和23型；血清型13和18則可能屬于E.inopinata[2-4]。在所有的丹毒絲菌中，其中以豬丹毒的流行范圍最廣，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬丹毒絲菌血清1、2型在豬群中分離率最高（占75%～80%）。近年來，家禽丹毒絲菌感染已有過不少的報(bào)道，其中以火雞感染造成的損失最為嚴(yán)重。各日齡的火雞均易感，感染后主要表現(xiàn)為虛弱、精神沉郁、腹瀉和猝死，產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量下降[5]。

本研究先后對兩個(gè)出現(xiàn)產(chǎn)蛋異常的鴨群進(jìn)行診斷，從送檢鴨腦組織中分離到2株細(xì)菌，經(jīng)過對分離株的16S rRNA基因序列分析鑒定為豬丹毒絲菌，并通過小鼠感染試驗(yàn)對分離株的毒力進(jìn)行了檢測，同時(shí)，采用生長凝集試驗(yàn)對3個(gè)不同鴨場的種鴨血清樣本進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 病例概況 病例1為60周齡北京鴨父母代種群，臨床表現(xiàn)為死淘率偏高，日均死亡率為0.2%～0.3%，飲水應(yīng)用多種抗生素未能降低死亡率，送檢4只，剖檢主要表現(xiàn)為肝臟輕度腫大、質(zhì)脆，個(gè)別鴨脾臟腫大，其他臟器無明顯的肉眼病變。

病例2為40周齡北京鴨父母代種群，鴨群外表正常，但產(chǎn)蛋最高峰始終維持在84%左右。送檢3只死淘鴨，剖檢無明顯的肉眼病變。

1.2 病原分離和鑒定

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 取腦、肝臟組織分別接種于添加2%小牛血清的胰酶大豆瓊脂平板（TSA，BD公司），于燭缸37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。待細(xì)菌生長后，挑取可疑菌落劃線接種于TSA平板，于燭缸37℃培養(yǎng)24 h。經(jīng)過傳代純化培養(yǎng)后對分離細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色和鏡檢。

1.2.2 16S rRNA基因擴(kuò)增及序列分析 挑選單個(gè)菌落接種于10mL添加1%小牛血清的胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB，BD公司）中，37℃搖振培養(yǎng)18 h。離心收獲細(xì)菌，采用StarPrep Bacterial DNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取細(xì)菌基因組DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

利用細(xì)菌16S rRNA保守區(qū)通用引物[6]，以細(xì)菌的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）為：Taq Mix（Genstar）12.5μL，DNA模板1μL，上、下游引物各1μL，加滅菌雙蒸餾水至25μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃，5 min；95℃40 s，54℃40 s，72℃50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢查。剩余20μL產(chǎn)物經(jīng)純化后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行核酸序列測定。獲得的序列結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行比較，確定細(xì)菌種屬。

1.2.3 多重PCR檢測spa基因 根據(jù)Shen等的報(bào)道[11]，合成針對丹毒絲菌的spa A、spa B和spa C基因的特異性引物（見表1），采用多重PCR方法擴(kuò)增spa基因。多重PCR 20μL反應(yīng)體系：10μLPCRMix（Gene star），上、下游引物各0.5μL（10μmol/L），模板DNA 1μL，加水至20μL。PCR的反應(yīng)條件為：95℃，5min；95℃，40 s，55℃，40 s，72℃，1min，30個(gè)循環(huán)；之后72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢查。

表1 spa基因PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.4 細(xì)菌藥物敏感性檢測 將細(xì)菌接種于TSB培養(yǎng)基，于37℃搖振培養(yǎng)過夜，之后將菌液濃度調(diào)整至108CFU/mL，均勻涂布于TSA平板上，然后放置不同藥敏紙片（購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司）,37℃培養(yǎng)18 h后讀取結(jié)果。

1.2.5 病毒分離 為了檢查鴨群是否發(fā)生病毒性感染，在進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的同時(shí)，取肝臟、脾臟和腦組織混合后，加滅菌緩沖液制成20%懸液，研磨并凍融2次后，用孔徑0.22μm濾器過濾除菌，經(jīng)尿囊腔途徑接種5枚9日齡鴨胚（0.3 mL/枚），37℃孵育觀察5 d，收集鴨胚尿囊液盲傳2代。

1.3 細(xì)菌毒力檢測 取6周齡雌性BALB/c小鼠45只，分成9組。從9組中隨機(jī)選出1組作為陰性對照組，余下8組分別接種2個(gè)分離株。菌液的稀釋度分別為10-2、10-3、10-4和10-5，經(jīng)腹腔注射0.2 mL/只，對照組注射0.2 mL PBS，觀察8 d并記錄小鼠臨床表現(xiàn)和死亡情況。同時(shí)將接種的菌液用無菌PBS作10倍系列稀釋，涂布于TSA平板，37℃過夜培養(yǎng)，計(jì)算活菌含量。

1.4 鴨血清抗體檢測 利用分離株B作為抗原，參照Y.Shimazaki等報(bào)道的生長抑制凝集試驗(yàn)方法進(jìn)行[8]。具體試驗(yàn)方法如下：（1）預(yù)先將96孔V型板在75%酒精中浸泡4 h，并在用前將其靜置與超凈工作臺中紫外照射30min左右，風(fēng)干；（2）在96孔V型板上，每孔加80μL TSB培養(yǎng)基（pH值7.6含有0.1%Tween-80，25μg/mL慶大霉素，250μg/mL卡那霉素），在第1孔中加待檢血清100μL，之后做2倍系列稀釋。每板中選2孔以SPF雞血清、無丹毒絲菌感染雛鴨血清為陰性對照；（3）將TSB液體培養(yǎng)的細(xì)菌作為抗原加到V型板中，每孔5μL；4）將96孔V型板放置在無菌的大平皿中，同時(shí)于平皿中加一滅菌水浸泡過的無菌紗布以保持平皿內(nèi)部的濕潤，37℃作用24 h。結(jié)果判定：若血清樣本中有抗體存在，在V型孔底部則出現(xiàn)菌體凝集、上清澄清，且傾斜V型板不流動(dòng)；若為陰性，則培養(yǎng)液渾濁底部有菌體沉淀，無凝集，傾斜V型板可見菌體沉淀流動(dòng)；如抗體效價(jià)達(dá)到或者高于1∶16，即判斷為豬丹毒絲菌抗體陽性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及培養(yǎng)特性 組織樣本經(jīng)無菌處理后接種鴨胚并盲傳2代均未引起胚體死亡或出現(xiàn)肉眼病變。尿囊液血凝檢測為陰性，初步排除病毒感染。

從2個(gè)鴨場送檢的鴨腦組織中分離到2株細(xì)菌，分別命名為Ery-BJa株和Ery-BJb株。分離菌在加血清的TSA平板上生長良好，菌落透明、表面光滑、微凹、圓形、邊緣整齊露珠狀小菌落。將在液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的細(xì)菌涂片進(jìn)行革蘭染色，結(jié)果2株細(xì)菌均為革蘭陽性，但在形態(tài)上兩株細(xì)菌存在較大差異，其中Ery-BJa株菌絲較長，菌絲中存在部分著色不均現(xiàn)象，而Ery-BJb株菌則較為短小，僅個(gè)別菌體較長。

2.2 16S rRNA基因鑒定 利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得預(yù)期片段大小約為750 bp(圖1)，核酸序列分析結(jié)果顯示2個(gè)分離株與已知的豬丹毒絲菌的同源性高達(dá)100%，判定為豬丹毒絲菌。

圖1 豬丹毒絲菌分離株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 spa基因多重PCR檢測 為了確定分離株的spa基因型，采用多重PCR對兩株細(xì)菌進(jìn)行了檢測，結(jié)果Ery-BJa株擴(kuò)增出大小約1 000 bp的片段，與報(bào)道的spa C型一致；Ery-BJb株的片段大小約900 bp，與spa B型一致（圖2）。

圖2多重PCR對豬丹毒絲菌分離株spa基因分型結(jié)果

2.4 細(xì)菌對小鼠的致病力 小鼠接種Ery-BJa菌后各組在感染后第2天未表現(xiàn)明顯的前驅(qū)癥狀即出現(xiàn)急性死亡高峰，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算A株的LD50為103CFU/0.2mL。Ery-BJb菌在接種后第4天和第5天出現(xiàn)死亡高峰，LD50≤102CFU/0.2mL。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 紙片法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)表明，此次分離菌株對慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、大觀霉素、紅霉素、萬古霉素、磺胺甲噁唑/甲氧芐及頭孢噻肟耐藥；對青霉素G、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、頭孢噻吩敏感。

2.6 鴨群抗體水平測定 采用生長凝集試驗(yàn)對3個(gè)種鴨場血清抗丹毒絲菌抗體水平檢測結(jié)果顯示，A場50份血清中，41份（82%）抗體水平可判為陽性（≥1∶16）。B場20份血清中，4份抗體水平可判為陽性。C場20份血清中，7份抗體水平可判為陽性。抗體水平具體分布見圖3。

圖3 A、B和C三個(gè)種鴨場鴨血清抗豬丹毒絲菌抗體水平分布

3 討論

本研究從北京地區(qū)2個(gè)出現(xiàn)生產(chǎn)性能異常的種鴨群分離到2株豬丹毒絲菌，并通過血清學(xué)檢測證明鴨群中均存在丹毒絲菌抗體陽性個(gè)體，表明種鴨群存在不同程度的豬丹毒絲菌感染。

據(jù)報(bào)道，豬丹毒絲菌不僅可造成雛火雞和雛鴨死亡，也可引起雄禽的授精能力下降和感染雞群產(chǎn)蛋下降[5]。Eriksson等報(bào)道，瑞典一蛋雞場發(fā)生丹毒絲菌感染引起死亡和產(chǎn)蛋下降，6 030只雞從60周齡到66周齡之間死亡1 861只[9]。Nakazawa曾報(bào)道幾乎所有的雞群均有丹毒絲菌污染[10]。Kurian等對新西蘭雞群進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，55個(gè)雞群中有46個(gè)為陽性（83%），檢查的545份血清的陽性率為39.8%，其中12周齡以上的陽性率明顯高于12周齡以內(nèi)的雞[11]。鴨和鵝自然感染也可引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Dhillon等報(bào)道過美國一鴨場北京鴨發(fā)生丹毒絲菌感染，2 000只的雛鴨群在15～21日齡死亡約700只，同時(shí)一個(gè)2 400只鴨的種鴨群每天的死亡率為4%～5%。剖檢變化為肝臟腫大、質(zhì)脆，漿膜下層有針尖狀出血點(diǎn)[12]。劉文華等從送檢的鴨肝臟組織中也分離到丹毒絲菌[13]，但有關(guān)種鴨丹毒絲菌感染的流行病學(xué)以及丹毒絲菌感染所造成的危害尚不完全清楚。本研究采用生長抑制凝集試驗(yàn)對3個(gè)鴨群的調(diào)查，結(jié)果血清學(xué)抗體陽性率分別為20%至82%，表明我國種鴨群存在不同程度的感染，與國外報(bào)道的雞群中血清抗體陽性率相近。其中，A場陽性率最高，B、C相對較低。所分離到的丹毒絲菌Ery-BJb株即從A場患病鴨群中分離得到，由此分析本場鴨群可能普遍感染過丹毒絲菌，但大部分個(gè)體呈耐過，而抗體水平在血清采集時(shí)依舊處于較高水平。B、C兩場并未分離到丹毒絲菌，也未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)癥狀個(gè)體出現(xiàn)。

丹毒絲菌的表面保護(hù)性抗原（surface protective antigen，spa）具有高度的免疫原性和保護(hù)原性。已報(bào)道的丹毒絲菌有3種spa型，即spa A、spa B和spa C，其中spa A主要存在于血清型1a、1b、2、5、8、9、12、15、16、17和N，spa B主要存在于血清型4、6、11、19和21，而spa C則主要存在于丹毒絲菌2株（E.sp.strain 2）血清型18種。同型spa蛋白的氨基酸高度同源，對同一spa型細(xì)菌感染具有完全的保護(hù)作用，但對異型的交叉保護(hù)作用相對較低。因?yàn)閟pa抗原是丹毒絲菌目前研究最為清楚的具有保護(hù)原性表面蛋白，所以鑒定細(xì)菌的spa型對確定的細(xì)菌的致病性和免疫原性具有重要的意義。采用多重PCR對2個(gè)分離株進(jìn)行spa基因分型結(jié)果表明分別屬于spa C型和spa B型，而國外報(bào)道的豬源分離株通常擁有spa A共同抗原，預(yù)示種鴨源菌株可能與豬群的流行株不同。因此，丹毒絲菌感染對商品鴨群的危害有待于進(jìn)一步研究。

此外，豬丹毒絲菌作為一種人畜共患病病原，人類感染主要表現(xiàn)為局部皮膚感染、類丹毒（一種全身性皮膚感染）和與心內(nèi)膜炎相關(guān)的敗血癥等3種病型，主要與所從事的職業(yè)有關(guān)，通常是接觸被污染的動(dòng)物、動(dòng)物性產(chǎn)品及排泄物而感染。最易被感染的人群有屠宰人員、獸醫(yī)、農(nóng)民、漁民等通過皮膚傷口感染[4]。因此該菌對公共衛(wèi)生安全也構(gòu)成一定的威脅，應(yīng)引起高度重視。

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