陜西奶牛隱性乳房炎病原菌的自動鑒定和耐藥性分析

付明哲，李長安，魏揀選，白 濤

（西北農林科技大學動物醫院，陜西 楊凌712100）

隱性乳房炎主要由病原微生物感染奶牛乳腺所引發的一種炎癥反應。該病臨床癥狀不明顯，但病牛產奶量下降，乳汁化學成分發生了變化。我國奶牛隱性乳腺炎的發病率為46.4%～85.7% ，經濟損失較大[1]。許多奶牛場獸醫缺乏病原學檢查的條件，僅憑經驗濫用抗生素治療乳房炎，導致病菌產生耐藥性。所以及時掌握該病致病菌的種類和耐藥性情況是防治該病的關鍵。細菌編碼自動檢測技術是快速檢測動物致病菌的一種新途徑，和傳統的病菌分離方法相比，具有快速、簡便和準確的優勢，耐藥性分析功能較強，但在我國獸醫臨床應用中鮮有報道[2]。2009-2013年，筆者從陜西省部分奶牛場采集隱性乳房炎病牛的乳樣，應用自動細菌鑒定及藥敏測試儀對隱性乳房炎病原菌進行了分離和藥物敏感試驗，旨在為指導治療隱性乳房炎合理用藥提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 被檢材料 乳樣采至陜西省56 個奶牛場，無菌采集體細胞計數在80 萬以上的陽性乳的乳樣431 份，置4 ℃冰箱內保存不超過24 h。

1.2 培養基及主要試劑 普通瓊脂、營養肉湯、麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板培養基、細菌生化卡、藥敏試驗卡，均由杭州天和微生物試劑有限公司生產；隱性乳房炎CMT 診斷液，由美國Immucell公司生產。

1.3 儀器設備 TDR-200B 自動細菌鑒定及藥敏測試儀（杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 隱性乳房炎檢測 CMT 法診斷為隱性乳房炎奶樣，每份奶樣取10 mL，3 000 r/min 離心5 min，棄去管中的上清液，取底部沉淀物備用。

1.4.2 自動生化鑒定 無菌吸取150 μL 沉淀物分別接種于培養基，37 ℃培養24 h，挑單個菌落革蘭染色，鏡檢后按照儀器說明分類進行生化鑒定。將菌落接種于生化培養液，制成菌懸液，用濁度計調整至0.5～1.0 麥氏單位，菌懸液分別加在鑒定板的各孔中，每孔100 μL，蓋上板蓋，標菌株號，置培養箱內35 ℃培養16～24 h。取出鑒定板，置閱讀器上自動檢索數據庫，記錄鑒定結果。

1.4.3 自動藥敏試驗 篩選3 種主要的致病菌，調好藥敏培養液，接種于藥敏試驗平板上，每孔150 μL，35 ℃培養18～24 h，儀器自動判斷結果，依據微生物分析系統M100 S18 版的標準判定耐藥菌，細菌耐藥率：耐藥率=耐藥菌株數/分離菌株數×100%。

1.5 統計方法 卡方檢驗和t 檢驗。

2 結果

2.1 主要病原菌分離情況 在431 份奶樣中，有411個檢出細菌714 株，細菌檢出率為95.36%。渭南市的85 份奶樣中有82 個檢出細菌170 株，檢出率為96.47%；西安市的97 份奶樣中有91 個檢出細菌155株，檢出率為93.81%；咸陽市的109 份奶樣中有101個檢出細菌204 株，檢出率為92.66%；寶雞市的140份奶樣中有136 份檢出細菌273 株，檢出率為97.14%。隱性乳房炎乳樣中分離到病原菌共17 種，其中主要致病菌為金黃色葡萄球菌（14.96%），無乳鏈球菌（15.64%），大腸桿菌（10.97%），乳房鏈球菌（6.23%），棒狀桿菌（5.61%），沙門菌和克雷伯氏菌（均占5.24%），酵母（4.99%），櫞酸桿菌（4.74%），壞死桿菌（4.49%），其他細菌的檢出率與主要致病菌差異顯著（P＜0.05）。乳樣的細菌分離情況見表1。2.2 病原菌的混合感染情況 陜西省4 個主要養牛區奶牛隱性乳腺炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌，鏈球菌和大腸桿菌。病原菌單獨感染率為5.15%～7.35%，由2 種細菌混合感染感染率為5.15%～11.30%，由3 種細菌混合感染感染率為38.97%～49.45%，結果見表2。

表1 致病菌自動分離結果

2.3 藥敏試驗 結果見表3。金黃色葡萄球菌對氨芐青霉素、環丙沙星、慶大霉素、復方新諾明、青霉素、諾氟沙星耐藥率為66.67%～91.67%。無乳鏈球菌對氨芐青霉素、環丙沙星、青霉素、慶大霉素、復方新諾明、紅霉素、鏈霉素耐藥率為63.78%～75.60%。氨芐西林、復方新諾明、四環素、阿奇霉素、紅霉素、林可霉素、諾氟沙星、青霉素、鏈霉素對大腸桿菌敏耐藥率為48.86%～100%。

表2 主要病原菌感染情況

3 討論

傳統的微生物檢測一般通過培養特性、菌落形態、染色特性、生化試驗及動物致病性試驗來確定病原菌，存在生化特性不穩定，操作繁瑣，費時費力等缺點[3]。而TDR-200B 自動細菌鑒定及藥敏測試儀通過檢測細菌在培養基中不同代謝特征和生長情況，結合編碼自動檢測技術及回歸統計，快速提供致病菌的生化鑒定和藥敏試驗結果[4]。在24 h 內將菌株準確鑒定到屬水平和菌種水平[5]。這種方法為細菌鑒定自動化、快速化及簡便化發展提供了條件[6]。陜西省奶牛場的隱性乳房炎主要病原菌共17種，分別為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、棒狀桿菌、沙門菌、克雷伯氏菌、酵母、櫞酸桿菌和壞死桿菌。國內一些學者用傳統細菌分離方法研究表明，隱性乳房炎的細菌檢出率一般在80%以上[7]，本次細菌自動分離檢出率為92.66%～97.14%。說明應用該儀器是一種微量、快速、敏感的鑒定致病菌方法。未檢出細菌的乳樣多因含有抗生素，部分是由支原體等其他病原引起的。

表3 主要致病菌的耐藥率

渭南、西安、咸陽和寶雞市隱性乳房炎感染的病原菌種類大體相似，但細菌感染的種類隨著抗生素的廣泛應用和衛生消毒措施的加強而發生動態變化，部分奶牛場隱性乳房炎已由鏈球菌、葡萄球菌轉為支原體感染為主，有的牛場隱性奶牛乳房炎的細菌感染以葡萄球菌為主變化為大腸桿菌感染為主。發生2種或2種以上病原混合感染率為63.51～69.52%，表明隱性乳房炎混合感染占大多數。鏈球菌是隱性乳房炎感染中最主要的致病菌，以無乳鏈球菌，停乳鏈球菌，糞鏈球菌為主。這與國內有關報道基本類似[8]。無乳鏈球菌是導致乳腺慢性感染的專性寄生菌，與其他細菌共同感染可發生臨床型乳腺炎[9]。金黃色葡萄球菌易引起乳房的肉芽腫與纖維變性，其致病力的強弱與毒力因子多樣性密切相關[10]。鏈球菌和金黃色葡萄球菌主要通過擠乳工、擠乳機傳播。

從目前的檢測結果來看，單獨環境性病原菌占到細菌總數的60%左右，檢出率最高為大腸桿菌，這些病原菌的檢出率有逐年增高的趨勢。奶牛在應激因素的刺激下，引起機體抵抗力降低，這些細菌借助圈舍、糞便、墊草、污水、擠奶器及飼養員在奶牛群中傳播和流行。因此，控制環境性病原菌的感染是防治隱性乳腺炎的關鍵措施，例如加強環境衛生和消毒措施，改善擠奶技術和設備，注意乳頭消毒減少環境性病原菌的感染；定期添加補氣健脾、活血化瘀的中草藥添加劑，保證精料中維生素和微量元素的含量，以增強奶牛抗病能力，每年檢測和治療隱性乳腺炎減少傳染源[11]。

由于奶牛乳腺特殊的生理結構和藥動學機制，全身或乳房局部給藥都很難使乳汁內抗生素達到有效濃度[12]。為了取得療效，獸醫通常選用高劑量的廣譜抗生素或將幾種抗生素聯合在一起給藥，盡管降低了感染率，但細菌對常用抗菌藥產生了不同程度的耐藥性[13]。因此，規模化養殖場應根據細菌分離鑒定及藥物敏感試驗結果合理選用抗菌藥物，嚴格遵守抗生素的使用用量、休藥期及藥物最高殘留量的規定，以延緩耐藥菌產生；盡量使用最廉價和最窄譜的抗生素，或者輪換應用抗生素，才能有效的控制隱性乳房炎的流行和傳播。

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