神經節苷脂誘導膠質瘤細胞自噬性死亡

馬明明，王雪晶，丁雪冰，張錢林，賀 爽，張杰文

(1．河南省人民醫院神經內科，河南鄭州450003;2．鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南鄭州450052;3．河南省人民醫院腎臟內科，河南鄭州450003)

神經節苷脂誘導膠質瘤細胞自噬性死亡

馬明明1，王雪晶2，丁雪冰3，張錢林1，賀 爽1，張杰文1

(1．河南省人民醫院神經內科，河南鄭州450003;2．鄭州大學第一附屬醫院神經內科，河南鄭州450052;3．河南省人民醫院腎臟內科，河南鄭州450003)

目的 探討神經節苷脂(GM1)對惡性腦膠質瘤細胞U251自噬性死亡的影響。方法 GM1作用U251細胞后，應用MTT法檢測細胞的存活率，流式法檢測細胞凋亡的改變，熒光顯微鏡下觀察MDC染色后細胞質內酸性自噬泡的形成情況及外源性LC3-Ⅱ的表達;Western blotting法檢測細胞自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2a、Beclin-1的表達。結果 與對照組相比，GM1作用48 h后，U251細胞存活率明顯降低，且具有劑量依賴性，差異有統計學意義(P＜0．05);與對照組相比，GM1作用48 h后，U251細胞凋亡率明顯升高，且具有劑量依賴性，差異有統計學意義(P＜0．05);GM1作用后細胞內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2a及Beclin-1的表達水平明顯上調，差異有統計學意義(P＜0．05)。結論 GM1可以誘導惡性腦膠質瘤細胞U251自噬性死亡，為惡性腦膠質瘤的治療提供新的方向。

自噬性死亡;神經節苷脂;U251細胞

神經節苷脂(monosialotetrahexosy 1 ganglioside，GM1)是哺乳類動物細胞膜的重要組成部分。以往研究［1]證實外源性GM1入血后，與脂蛋白結合，可通過血腦屏障進入中樞神經系統，并能夠高度濃集于受損病灶區域，參與神經修復及重構的病理過程，從而促進神經細胞功能的恢復。膠質瘤是最常見的顱內原發腫瘤，目前研究［2]已證實GM1能夠誘導膠質瘤細胞凋亡，但具體機制仍未明。本實驗以腦膠質瘤U251細胞為研究對象，探討GM1通過調控U251細胞自噬水平誘導其凋亡的具體機制。

1 材料與方法

1．1 細胞培養 人腦膠質瘤細胞系U251購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，常規培養于含體積分數12%胎牛血清的DMEM完全培養液中，置于37℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養，每1～2天換液1次。待細胞鋪滿培養瓶底90%后，以消化液(含質量分數0．30%胰蛋白酶和質量分數0．05%EDTA)消化，1∶4 比例稀釋、培養。

1．2 MTT法檢測細胞存活率 U251細胞接種于96孔板(密度為3×103/孔)，次日對照組給予常規DMEM培養液，實驗組分為5個濃度組，分別加入0、50、100、250 μg·mL－1的 GM1，每組設4 個復孔，培養48 h，棄去培養液，每孔加10 μL MTT和90 μL無血清DMEM培養液，37℃孵育2 h，棄去液體，加入150 μL DMSO振蕩溶解，酶標儀于570 nm波長處測量吸光度(A)值，細胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1．3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 實驗組加入0、50、100、250 μg·mL－1GM1，培養48 h 后，收集細胞，冷的PBS洗滌后棄去上清，重懸細胞于Annexin結合緩沖液，每份標本容量為120 μL，加入8 μL Alexa Fluor 488 AnnexinⅤ和 2 μL 100 μg·mL－1PI工作液，室溫下孵育15 min，向標本中加入400 μL Annexin結合緩沖液，在冰上輕輕混勻，立即將標本用流式細胞儀分析。

1．4 Western blot法分析蛋白表達 250 μg·mL－1GM1給藥24、48 h后收集細胞，提取總蛋白并檢測。經SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜后封閉，一抗4℃過夜，加入HRP標記的二抗，雜交爐孵育2 h，暗室中行X線膠片曝光，GAPDH設為內參。

1．5 細胞免疫熒光化學檢測 U251細胞培養于12孔板內，孔內預置入無菌蓋玻片。質量分數4%多聚甲醛固定5 min，質量分數15%BSA(0．25%TritoX-100)封閉，PBS洗3 次，加入 Hochest33258(1∶10 000)，孵育3 min，用Olympus IX70熒光顯微鏡觀察。

1．6 統計學處理 采用SPSS 13．0進行分析，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 GM1對U251細胞存活率的影響 MTT法檢測結果顯示:0、50、100、250 μg·mL－1GM1 作用 48 h后，U251 細胞存活率分別為(98．0 ±8．2)%、(79．3 ±12．2)%、(62．2 ±14．3)%、(51．2 ±7．3)%;與對照組比較，差異有統計學意義(P均＜0．05)。見圖1。

2．2 GM1 對 U251 細胞凋亡的影響 0、50、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h后，U251 細胞凋亡率為(2．1±0．3)%、(4．0 ±0．5)%、(20．1 ± 8．1)%、(40．2 ±7．0)%;與對照組比較，差異有統計學意義(P均＜0．05)。見圖 2。

2．3 Western blot分析 LC3、Lamp-2a、Beclin-1 水平的變化 GM1上調 LC3-Ⅱ表達水平，250 μg·mL－1GM1給藥0、24、48 h后，LC3-Ⅱ表達水平逐漸上調，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸上調，明顯高于對照組(P＜0．05);與對照組相比，Lamp-2a表達水平逐漸上調(P＜0．05);與對照組相比，Beclin-1表達水平逐漸上調(P ＜0．05)。見圖3。

2．4 免疫熒光顯示自噬體形成和LC3-Ⅱ表達 熒光顯微鏡下可見，250 μg·mL－1GM1 給藥 0、48 h 后，U251細胞內出現LC3-Ⅱ表達高亮點，呈顆粒狀聚集，說明自噬體形成，而對照組無此現象。見圖4。

3 討論

細胞有2種死亡方式:細胞壞死和程序性細胞死亡，其中程序性細胞死亡有Ⅰ型(細胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性細胞死亡)2種［3]。自噬是指溶酶體降解利用細胞內物質成分的過程［4]。細胞自噬的主要生理功能是及時清除細胞中產生的"垃圾"(如破損或衰老的細胞器、折疊錯誤的蛋白質等)，維持細胞內穩態。因此，無論是腫瘤細胞還是正常細胞，保持一種基礎低水平的自噬活性對細胞的生理活動至關重要，但過度細胞自噬則引起細胞的過量損傷導致細胞死亡［5]。

神經系統原發性腫瘤60%為膠質瘤，惡性膠質瘤預后差，平均生存周期不超過1 a［6]。手術是膠質瘤的主要治療方式，但侵襲到遠處的瘤細胞，往往難以清除，是復發的根源。其他治療手段如放療、化療對抑制膠質瘤的發展具有重要意義。越來越多的體內及體外實驗均證實自噬的調控在各種藥物過程中發揮了重要作用。替莫唑胺能夠誘導惡性膠質瘤細胞發生自噬，3－甲基腺嘌呤在抑制替莫唑胺誘導自噬的同時也削弱了其抗腫瘤效應;而 bafilomycin A1則通過活化caspase-3誘導凋亡增強了替莫唑胺的抗腫瘤效應［7]。三氧化二砷和神經酰胺通過上調線粒體的細胞死亡蛋白BNIP3誘導惡性神經膠質瘤細胞發生自噬性細胞死亡［8]。姜黃素能夠抑制該通路誘導自噬性惡性膠質瘤細胞死亡從而產生抗腫瘤效果［9]。原人參萜二醇同樣能夠降低Akt磷酸化水平從而誘導膠質瘤細胞系U87MG發生自噬性死亡［10]。本研究發現，隨著GM1濃度的增加U251細胞存活率明顯降低，凋亡率逐漸增加。進一步研究證實，隨著GM1濃度的增加可誘導U251細胞巨自噬及分子伴侶介導自噬的發生，從而導致膠質瘤細胞U251自噬性死亡。總之，本研究結果表明，GM1通過誘導自噬抑制了U251細胞的生長，促進細胞自噬性死亡過程;為GM1治療惡性腦膠質瘤提供了新的理論依據。

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Autophagic Cell Death Induced By Ganglioside

Ma Mingming1，Wang Xuejing2，Ding Xuebing3，Zhang Qianlin1，He Shuang1，Zhang Jiewen1
(1．Department of Neurology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003，China;2．Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China;3．Department of Nephrology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003，China)

Objective To investigate the effect of monosialotetrahexosy 1 ganglioside(GM1)on autophagic cell death in malignant glioma U251 cells treated with GM1．Methods The viability of cells was measured by MTT assay．The cell apoptosis was assayed by flow cytometry．Autophagic features were determined by fluorescence microscope．The autophagy-related protein expressions of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Lamp-2a and Beclin-1 were assessed by Western blotting．Results After treatment of GM1 for 48 hours，the growth of U251 cells were significantly inhibited in dose-dependent manner(P ＜0．05);and GM1 increased autophagic cell death also in dose-dependent manner(P ＜0．05)．Compared with the control group，the levels of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Lamp-2a and Beclin-1 were significantly increased in GM1 treatment groups(P ＜ 0．05)．Conclusion GM1 enhances autophagic cell death of malignant glioma U251 cells，which provides a novel strategy to treat drug-resistant malignant glioma．

autophagic cell death;monosialotetrahexosy 1 ganglioside;U251 cells

R730．264;R730．23

A

1673－5412(2012)04－0281－03

2012－02－02)

馬明明(1976－)，男，博士，主治醫師，主要從事腦血管病發病機制和遺傳學研究。E-mail:macklon12@yahoo．com．cn

張杰文(1965－)，男，博士，主任醫師，主要從事老年性癡呆和神經退行性疾病的研究。E-mail:zhangjiewen9900@126．com