臨床實驗室檢測方法空白限、檢出限和定量限評價新方法

衛生部北京醫院衛生部臨床檢驗中心（100730） 康鳳鳳 王 薇 王治國

臨床實驗室檢測方法空白限、檢出限和定量限評價新方法

衛生部北京醫院衛生部臨床檢驗中心（100730） 康鳳鳳 王 薇 王治國△

臨床實驗室檢測方法的下限性能是非常關鍵的，尤其是當分析物在低濃度水平有重要臨床意義時。最早采用術語“分析靈敏度”，即可檢測的最低分析物濃度，該定義僅基于空白樣本的重復試驗。同時出現的另一術語為“功能性靈敏度”，即測量程序長期不精密度（coefficient of variation，CV）為20%時對應的濃度水平，該定義基于精密度分布圖。2004年，美國臨床和實驗室標準化研究院（CLSI）頒布了EP17-A文件：檢出限和定量限的測定方案；批準指南［1］；2012年6月，CLSI又頒布了EP17-A2文件：臨床實驗室測量程序檢測能力評價；批準指南（第二版）［2］。由于“分析靈敏度”與術語“檢出限”或“檢測下限”在一定程度上可互換，而“功能性靈敏度”又易與術語“臨床靈敏度”、“閾值”等混淆，因此這兩個文件推薦了新的術語描述檢測下限性能：空白限（limit of blank，LoB）、檢出限（lim it of detection，LoD）和定量限（limit of quantitation，LoQ）。LoB定義為空白樣本的系列結果中的最大值；LoD定義為方法可檢出的最低被測物濃度；LoQ定義為能可靠檢出分析物且檢測結果的不確定度滿足實驗室既定目標的實際濃度。

目前，檢測下限性能評價方法主要為EP17-A指南推薦的經典法，但該方法僅適用于定量檢測方法，要求數據具有方差齊性。最新頒布的EP17-A2指南提出了兩種新的方法：精密度分布圖和概率單位法（probit法）。本文將結合具體實例，探討臨床實驗室如何使用這3種方法建立LoB，LoD和LoQ。

空白限和檢出限

1.經典法

該方法由EP17-A文件中提出，要求各低濃度樣本的測量結果具有方差齊性。LoB由空白樣本的結果確定，檢測結果高于該值為真正空白樣本的可能性很小。此處可能犯Ⅰ類錯誤，即真正空白樣本錯誤判斷為陽性樣本，其風險為α。相反，真正低濃度樣本可能被錯誤判斷為陰性樣本，即犯Ⅱ類錯誤，相關風險為β。實際應用中，通常假設α＝β＝0.05，臨床實驗室可根據特定測量程序確定合理的α和β。

（1）研究設計 以雌二醇免疫法測量程序為例，默認α＝β＝0.05。空白樣本來源健康人群血清標本，利用免疫吸附法去除內源性雌二醇。利用濃度為0 pg/m l的校準品對其進行重復性研究（n＝20）。測量結果的最大值為7pg/m l，以此作為LoB初始估計值，并確定低濃度樣本的期望范圍為7～35pg/m l（LoB的1～5倍）。選擇5個空白樣本和5個低濃度樣本，分別用兩個批號的試劑對各個標本重復檢測，每天重復檢測4次，連續檢測3天，最終每個試劑批號分別有60個空白結果和低濃度結果。

（2）數據分析

①LoB估計 采用非參數方式計算LoB［3］：

1）將60個空白樣本的檢測結果按從小到大的方式進行排序；

2）α＝0.05，計算空白樣本結果分布的百分位數（Pct），即Pct＝0.95；

3）根據Pct計算空白樣本的排列位置，即排列位置＝0.5＋60×0.95＝57.5。排列位置必須是整數，應根據第57和58位的結果進行計算，LoB＝X57＋0.5（X58-X57）。兩個批號試劑對應的LoB估計值分別為7.6pg/m l和9.4pg/m l。將兩個批號的較大值作為最終的LoB估計值，即9.4pg/m l。注意如果研究包含4個或以上的試劑批號，可直接用所有數據按步驟1）～3）計算LoB，因為4個以上的試劑批號已很大程度降低了批間變異。

②LoD估計 LoD估計多采用參數分析法，如果低濃度樣本測量結果不具方差齊性，可采用非參數分析法或下文的精密度分布圖。

1）分別對每個試劑批號的每個低濃度樣本計算標準差（si）；

2）計算每個試劑批號的J個低濃度樣本的總標準差（sL）

（si為第i個低濃度樣本所有結果的標準差，ni為第i個低濃度樣本所有結果數，J為低濃度樣本數）；

3）計算LoD：LoD＝LoB＋cpsL，cp＝為正態分布95百分位數的乘數因子，L為所有試劑批號所有低濃度樣本結果總數；

4）計算過程與結果如表1所示，兩個批號的LoD估計值分別為14.5pg/m l和13.8 pg/m l，取較大的14.5 pg/m l作為測量程序的最終LoD估計值。

表1 LoD估計（單位pg/m l）

2.精密度分布圖

精密度分布圖是以系列濃度水平為橫坐標，以濃度水平相應的不精密度為縱坐標的函數關系曲線，表示分析系統對不同濃度樣本的精密度差異。該方法僅用于LoD的測定，尤其適用于測量結果在假定LoD附近的變異很大，或者臨床實驗室未對LoD進行明確估計，期望獲得更寬的測量濃度范圍［4］。精密度分布圖最早用于功能性靈敏度的測定，后來逐漸發展成為一模型，用于其他分析物，如甲狀腺激素、前列腺特異性抗原（prostatic specific antigen，PSA）等。

（1）研究設計 以PSA免疫學試驗為例，初步精密度試驗顯示該測量程序變異性隨著分析物濃度增加而增大，采用精密度分布圖評價LoD。利用免疫吸附法去除血清樣本中的內源性分析物作為空白樣本，經典法計算LoB估計值為0.51ng/m l。選擇至少5個低濃度樣本，每天分別用兩個批號的試劑對各個標本重復檢測5次，連續檢測5天。

（2）數據分析

①按照CLSIEP05文件中描述的方法，計算各樣本的均值和實驗室內精密度（sWL）的估計值［5］，如表2所示；

②選擇合適的模型擬合精密度分布圖數據，初步觀察該曲線為二階多項式，利用excel執行多項式模型回歸：sWL＝0.3741＋0.0149X＋0.0055X2（批號1），sWL＝0.2801＋0.0817X＋0.0017X2（批號2），精密度分布圖見圖1；

③從LoB分析物濃度開始，根據精密度分布圖模型計算預期實驗室內精密度（sWL），按公式計算LoD：LoD＝LoB＋cpsWL，計算cp＝1.646。LoD＝0.51＋ 1.646×（0.3741＋0.0149×0.51＋0.0055×0.512）＝1.14（批號1），LoD＝0.51＋1.646×（0.2801＋0.0817 ×0.51＋0.0071×0.512）＝1.047（批號2）。批號1和批號2的LoD估計值都不等于起始分析物濃度0.51ng/m l，因此從0.50 ng/m l開始，每次增加0.1，逐漸增加分析物濃度，計算預期sWL及相關的LoD，直到得到一個擬合的LoD估計值的分析物濃度；

④選擇兩個批號中較大者作為最終的LoD估計值，報告該測量程序的LoD為1.16ng/m l。。

表2 各樣本測量均值和實驗室內變異（單位ng/m l）

圖1 兩個試劑批號的精密度分布圖

3.概率單位法（probit法）

該方法適用于當測量程序的檢測能力以比例（陽性結果數/重復檢測的總數）的形式表示時，最早應用于殺蟲效率的評價，目前已廣泛用于其他領域中［6-7］。典型的probit法遵循有限稀釋的劑量-反應方案，即從已知測量濃度的樣本開始作一系列稀釋，然后測量程序對這些稀釋物進行重復檢測，得到兩種結果：檢出或未檢出。對每個稀釋濃度，計算“檢出”測量結果數/總的重復測量數的比例（命中率）。將這些命中率轉化為累積正態概率單位，并用回歸模型對各自的測量濃度進行修勻。最后用回歸模型計算預期命中率（如0.95）的測量濃度，即LoD。該方法尤其適用于分子檢測或其他利用PCR技術進行擴增和檢測的測量程序，其沒有陰性樣本結果的分布，LoB通常報告為0。

（1）研究設計 以檢測細菌DNA的分子診斷試驗為例，對某患者樣本進行系列稀釋得到5個稀釋度，分別用3個試劑批號進行重復檢測，每天重復檢測2次，連續檢測3天，保證獲得至少20個重復檢測結果。

（2）數據分析

①取α＝β＝0.05；默認LoB為0，用陰性患者樣本進行確認，即某個試劑批號的陰性樣本檢測結果為0的比例大于100（1-α）%，或者用經典法估計LoB；

③利用專業統計軟件（如SPSS等）進行probit回歸分析，以分析物濃度為X軸，命中率為Y軸，繪制probit曲線。選擇Pearson卡方檢驗和對數似然比卡方檢驗檢測probit模型的吻合性。圖2～4分別為3個試劑批號的probit曲線。

④模型擬合可接受，通過曲線查找通常0.95命中率下的分析物濃度，將該值作為特定批號的LoD。3個試劑批號的LoD分別為0.077 CFU/m l、0.033 CFU/m l和0.031 CFU/m l，將最大值0.077CFU/m l作為測量程序的最終LoD估計值。

表3 各樣本命中率結果

圖2 probit曲線（批號1）

圖3 probit曲線（批號2）

定量限

建立測量程序時應建立LoQ，臨床實驗室可根據實際情況選擇特定的準確度目標，通常以允許總誤差（total error allowable，TEa）目標或偏倚和精密度目標的形式進行定義。

圖4 probit曲線（批號3）

1.研究設計

仍以免疫法雌二醇測量程序為例，基于經典方法測定LoD。其準確度目標TEa＝21.6%，后者根據C.Ricos教授提供的生物學變異數據庫建立的適當的允許總誤差質量規范［8］。采用經典的Westgard模型定義總誤差（total error，TE）［9-10］利用前文的LoB/LoD數據，選擇一個靶濃度作為試驗LoQ，LoQ應大于LoD。根據該濃度制備多個低濃度樣本進行重復檢測，本例為4個樣本，用2個試劑批號進行重復檢測，每天檢測3次，連續檢測3天。

2.數據分析

（2）利用Westgard TE模型計算每個試劑每個樣本的TE，如表4所示。將每個試劑批號的TE估計值與既定準確度目標進行比較，以滿足準確度目標的最低濃度作為該批號的LoQ；

表4 低濃度樣本的觀察均值、標準差和總誤差

（3）本例中所有樣本的TE都不滿足21.6%。作分析物濃度總誤差分布圖（線性回歸模型），如圖5所示，推測準確度目標21.6%對應的濃度約為35pg/m l。制備靶濃度為40pg/m l的5個混合樣本，用ID-GC/MS檢測得到參考值，并確認其在期望分析物濃度范圍內（40±10 pg/m l）。用2個試劑批號進行重復檢測，每天檢測3次，連續檢測3天，重復步驟（1）和（2）；

圖5 分析物濃度總誤差分布圖

表5 各樣本總誤差及定量限的計算過程

臨床實驗室應驗證檢測系統廠家提供的檢測下限性能聲明，根據檢測系統和研究數據的分布特性，選擇合適的方法設計LoB、LoD和LoQ的研究方案。研究方案的設計可根據實際情況適當調節，但必須滿足最低的重復檢測數要求。

1.CLSI.Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation；Approved Guideline.CLSI document EP17-A.Wayne，PA： Clinical and Laboratory Standards Institute，2004.

2.CLSI.Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures；Approved Guideline—Second Edition.CLSI document EP17-A2.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

3.王治國主編.臨床檢驗方法確認與性能驗證.北京：人民衛生出版社，2009.

4.Ekins RP.The“precision profile”：its use in RIA assessment and design.Ligand Quarterly，1981，4（2）：33-44.

5.CLSI.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods；Approved Guideline—Second Edition.CLSI document EP05-A2.Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2004.

6.Bliss CI.Themethod of probits.Science，1934，79（2037）：38-39.

7.Burd EM.Validation of labor atory-developed molecular assays for infectious diseases.Clin M icrobiol Rev，2010，23（3）：550-576.

8.Ricos C，Iglesias N，Garcia-Lario JV，et al.W ithin-subject biological variation in disease：collated data and clinical consequences.Ann Clin Biochem.2007，44（4）：343-352.http：//www.westgard.com/biological-variation-in-patients-w ith-disease.htm.Accessed May 14，2012.

9.Westgard JO，Carey RN，Wold S.Criteria for judging precision and accuracy in method development and evaluation.Clin Chem，1974，20（7）：825-833.

10.Petersen PH，St?ckl D，Westgard JO，et al.Models for combining random and systematic errors：assumptions and consequences for different models.Clin Chem Lab Med，2001，39（7）：589-595.

（責任編輯：劉 壯）

△通信作者：王治國，E-mail：zhiguo_w＠hotmail.com