黃藥子及配伍甘草對大鼠肝臟CYP450基因表達的影響

華碧春，黃智鋒，劉嬌，程心玲，陳小峰，王英豪，卓實

·藥理毒理·

黃藥子及配伍甘草對大鼠肝臟CYP450基因表達的影響

華碧春1，黃智鋒1，劉嬌1，程心玲2，陳小峰3，王英豪1，卓實2

目的：考察甘草對黃藥子引起的肝損傷的CYP450酶基因表達的影響。方法：采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）技術檢測大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C19的mRNA的表達。結果：在mRNA水平上，28天、35天黃藥子組均顯著誘導CYP1A2的基因表達，配伍甘草后表達降低，具有統計學意義。甘草組可微弱下調CYP2C19的表達，但與配伍組相比無統計學意義。結論：甘草通過抑制CYP1A2的mRNA表達，對黃藥子致肝損傷具有一定保護作用。

黃藥子；甘草；CYP450；基因表達；配伍減毒

中藥致肝損害已成為我國中藥安全性評價面臨的重要問題。據不完全統計，世界范圍內有包括草藥和非法藥物在內的大于1100種的藥物可引起肝損害[1]，國內已報道有100 多種中草藥和30 多種中成藥可引起肝損害[2]。肝臟是大部分藥物轉化代謝的場所，有研究表明藥物性肝損害的發生與肝組織內細胞色素P450的高表達密不可分[3]。本實驗以前期實驗[4～6]為基礎，通過大鼠肝臟CYP450基因mRNA表達的影響來探究黃藥子甘草1∶2配伍組減輕黃藥子致大鼠肝損傷時間蓄積性的實驗機制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黃藥子飲片，產地四川，批號120724，購自福建回春醫藥連鎖有限公司，經福建中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為薯蕷科植物黃獨Dioscorea bulbifera L.的塊莖。甘草飲片，產地甘肅，批號12030506，購自福建回春醫藥連鎖有限公司，經福建中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza infata Bat.的干燥根和根莖。

Trizol（Lot:15596-026，Invitrogen），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (RT-PCR，Lot: 00102205，Fermentas)，DreamTaq? Green PCR Master Mix (Lot: 00124582，Fermentas) ，50bp DNAmarker（Lot:1304G15，上海捷瑞生物工程有限公司） CYP1A2、CYP2C19、β-actin引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。異丙醇、氯仿、無水乙醇等均為國產分析純。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠，SPF級，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.3 實驗儀器及設備

核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf）、PCR擴增儀（S1000TM Thermal Cycler 美國BIO-RAD）、冷凍臺式高速離心機（德國Eppendorf）、電泳儀（美國BIO-RAD）、全自動凝膠成像系統（Gel DocTM XR+ Imaging System美國BIO-RAD）。

2 方法

2.1 藥液制備

黃藥子飲片烘干，粉碎，8倍量水浸泡60 min，煎煮60 min；2次煎煮5倍量水煎煮30 min，合并2次藥液；過濾，經3000 r．min-1離心 10 min，除去藥渣，再次濃縮至1 g．mL-1（以黃藥子生藥量計，下同）。黃藥子甘草1∶2配伍組(后文簡稱“配伍組”)合煎液同法煎煮制備，濃縮至1 g．mL-1。

2.2 動物分組及給藥

雄性SD大鼠，體重200±20 g，隨機分為6組，按給藥劑量： 9 g．kg-1（黃藥子組）、9 g．kg-1（配伍組，黃藥子生藥量）和空白對照組（等體積蒸餾水）。分別于灌胃28天和35天處死，迅速取出肝臟，置液氮中保存。

2.3 CYP1A2、CYP2C19 mRNA表達

應用Invitrogen公司的TRIzol?試劑、氯仿及異丙醇試劑提取大鼠肝臟組織中的總RNA，測得A260/ A280比值1.8～2.0，所提總RNA可用。逆轉錄反應以Fermentas公司的RT-PCR試劑盒說明書操作，逆轉錄條件為42℃ 60 min、70℃ 5 min，合成第一條cDNA鏈。PCR反應以逆轉錄產物1.0 μL為模板，加入上下游引物各0.8 μL，Green PCR Master Mix 10 μL，Rnase-free H2O 7.4 μL，使反應終體積為20 μL。PCR反應條件為：95℃預變性3 min；循環時95℃ 30 s，CYP1A2、β-actin 53℃退火30 s、CYP2C19 47℃退火30 s，72℃延伸30 s；擴增的循環數分別為35、35、32；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳并與DNA標準分子量比較鑒定后，在數字成像儀拍照、分析。特異性引物序列見表1。

表1 CYP 1A2、CYP2C19、β-actin基因引物序列信息

2.4 統計學處理

3 結果

由表2、圖3可見：與空白組比較，28天、35天黃藥子組均上調了CYP1A2的mRNA的表達（P＜0.05或P＜0.01），且35天組較28天組誘導作用更顯著（P＜0.01）；與黃藥子組比較，28天、35天配伍組抑制了CYP1A2的mRNA的表達（P＜0.05或P＜0.01），具有統計學意義；28天、35天黃藥子組、配伍組上調了CYP 2C19 的mRNA的表達，但表達無明顯差異，無統計學意義。

表2 黃藥子及配伍甘草對大鼠肝臟CYP450亞型mRNA表達水平的影響（）

表2 黃藥子及配伍甘草對大鼠肝臟CYP450亞型mRNA表達水平的影響（）

注：與對應天數空白組比較 a P＜0.05，c P＜0.01，e P＞0.05；與對應天數黃藥子組比較 b P＜0.05，d P＜0.05，f P＞0.05

組別 CYP1A2/β- actin CYP2C19/β- actin 動物數（n）28天黃藥子組 2.415±1.432a 1.358±0.955e 10 28天配伍組 1.053±0.261b 1.099±0.677f 9 28天空白組 1.082±0.175 0.743±0.503 8 35天黃藥子組 2.283±1.032c 1.350±0.420e 10 35天配伍組 1.325±0.561d 1.015±0.358f 9 35天空白組 1.232±0.586 0.985±0.395 8

圖3 不同處理組CYP1A2、CYP2C19 PCR產物凝膠電泳結果

4 討論

4.1 中藥配伍理論作為中醫藥理論的重要組成部分，已有幾千年的應用歷史，配伍減毒更是臨床常用的有效手段。配伍后的作用機制已成為近幾年中藥現代化研究的熱點，本研究正是應用RT-PCR技術檢測肝臟CYP450酶mRNA的表達影響，探討甘草減輕黃藥子肝毒性的作用機制。

4.2 現代藥理學認為，CYP450 酶的誘導或抑制是藥物相互作用最常見的原因之一。CYP1A2與藥物代謝關系較為密切，其占肝臟總P450氧化酶含量的13%，僅次于CYP3A和CYP2C家族，參與了黃曲霉毒素B1、多環芳烴等前致癌物以及咖啡因、非那西丁硝苯地平、丙咪嗪等20 余種藥物的代謝活化過程，其在內源性底物和環境毒素的代謝過程中起到了重要作用；CYP 2C家族占成人肝微粒體CYP450總量的20%左右，能代謝巴比妥類、丙咪嗪、奧美拉唑、華法林等藥物，多數內源性底物、前致癌物、前毒物、臨床大約2%的藥物的代謝及毒性反應與CYP2C19相關。文獻報道[7]，黃藥子的不良反應主要是引起肝損害，且其對肝臟的損害屬于對肝細胞直接毒性作用。因此，通過CYP1A2、CYP2C19的mRNA的表達研究甘草減輕黃藥子致肝臟毒性損害及臨床合理應用黃藥子具有重要意義。

4.3 本研究結合傳統中醫藥配伍理論，結合前期實驗基礎以及文獻資料的報道，同時根據臨床病例長期、大量服用黃藥子及其制劑的特點，通過大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C19的mRNA表達的影響探究黃藥子甘草1∶2配伍組減輕黃藥子致大鼠肝損傷時間蓄積性的實驗機制。28天、35天黃藥子組均顯著上調了CYP1A2的mRNA表達，配伍甘草后CYP1A2的mRNA表達降低。提示甘草可能通過抑制CYP1A2的mRNA表達，對黃藥子致肝損傷有保護作用。28天、35天黃藥子組對CYP2C19基因表達有一定誘導作用，然配伍甘草后表達微弱下降，但與黃藥子組相比，無統計學差異。可見CYP2C19雖與多數內源性底物、前致癌物、前毒物代謝及毒性反應有關，但該基因并不參與黃藥子致肝損傷的調控；抑或是因為CYP2C19存在遺傳多態性，存在多個等位基因，黃藥子致肝損傷是否與CYP2C19多態性等位基因的mRNA表達有關，還有待進一步研究。4.4 CYP450酶作為藥物代謝重要酶系，在中藥配伍增效減毒上起著重要作用。黃藥子苦寒，攻散之性較強，治療癌腫、甲狀腺疾患用藥時間長，易耗正氣；甘草能緩和黃藥子苦寒之性，補脾益氣、保肝利膽、清熱解毒。本實驗從基因水平探討黃藥子肝損傷及配伍甘草減毒的機制，豐富和發展了中藥甘緩解毒的藥性理論和相畏、相殺的配伍理論，為臨床合理應用黃藥子提供了實驗依據。下階段，我們將繼續對CYP1A2、CYP2C19酶含量和活性及蛋白表達的影響深入研究，同時增加與肝損傷相關的CYP亞型的實驗，以闡明黃藥子致肝損傷的機制及甘草減輕黃藥子肝毒性的作用機制。

[1] Jonathan G Stine,James H Lewis.Durg-induced liver injury: a summery of recent advances[J].Expert Opin.Drug Metab. Toxicol,2011,7(7):875.

[2] 華碧春,盧榜華.中草藥的藥物性肝損害[J].福建中醫藥大學學報,2000,10(1):30.

[3] Pelkonen O,Raunio H.Metabolic activation of toxins: tissuespecifc expression and metabolism in target organs[J].Environ Health Perspect,1997,105:767.

[4] 華碧春,胡娟,王瑞國,等.甘草降低黃藥子致小鼠肝毒性的實驗研究[J].世界中西醫結合雜志,2011,6(1):24.

[5] 華碧春,馬麗娜.黃藥子配伍甘草分煎液與合煎液中黃獨乙素含量的比較[C].第五屆全國臨床中藥學學術研討會論文集,2012:215.

[6] 華碧春,卓實,史道華,等.甘草減輕黃藥子肝毒性的實驗研究[J].福建中醫藥大學學報,2013,23(1):23.

[7] 唐迎雪.黃藥子古今臨床應用研究[J].中國中藥雜志,1995,20 (7):435.

（責任編輯：陳思敏）

Effects of the compatibility of Huangyaozi and Gancao on the CYP450 mRNA expression in rat liver

HUA Bi-chun1, HUANG Zhi-feng1,LIU Jiao1, CHENG Xin-ling2, CHEN Xiao-feng3, WANF Ying-hao1,ZHUO Shi2//(1.School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122; 2.The First Affliated Hospital of Fujian Province, Fuzhou 3500042; 3.The Second People’s Hosptial of Fujian Province, Fuzhou 3350003)

Objective:To study the effects of the compatibility of Huangyaozi and Gancao on the CYP450 mRNA expression in rat livers.Method:The mRNA levers of the expression of the CYP1A2 and CYP2C19 gene of the rat liver were assayed with RT-PCR. Result: The mRNA levels of CYP1A2 were induced signifcantly by group of Huangyaozi after medication for 28 days and 35 days separately and reduced after given the compatibility with Gancao. Conclusion: The mRNA expression of CYP1A2 was inhibited by Gancao to protect liver from injury which caused by Huangyaozi.

Huangyaozi; Gancao; CYP 450; gene expression; decrease toxicity by compatibility

R 285.5

A

1674-926X(2014)04-005-03

國家自然科學基金項目（No：81274105）

1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建省人民醫院，福建 福州 350004；3.福建省第二人民醫院，福建 福州 350003

華碧春(1962- )，女，主要從事中藥學研究Email:1625399195@qq.com

2013-10-21