細(xì)氈毛忍冬血清藥物化學(xué)初步研究

付燕偉，黎豫川，陀揚(yáng)凌，唐瑜，張旭

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細(xì)氈毛忍冬血清藥物化學(xué)初步研究

付燕偉，黎豫川，陀揚(yáng)凌，唐瑜，張旭

目的：對(duì)細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物進(jìn)行血清藥物化學(xué)研究，為篩選確定細(xì)氈毛忍冬的藥效成分奠定基礎(chǔ)。方法：建立細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物及大鼠含藥血清、空白血清的HPLC指紋圖譜分析方法；通過比較細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物、含藥血清及空白血清指紋圖譜，確定其血清移行成分。結(jié)果：在含藥血清中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)移行成分，其中2個(gè)為原型成分，6個(gè)是代謝產(chǎn)物。結(jié)論：血中移行成分和代謝產(chǎn)物可能成為細(xì)氈毛忍冬的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，對(duì)其更深入的研究有助于探索其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。

細(xì)氈毛忍冬；血清藥物化學(xué)；移行成分

中藥血清藥物化學(xué)是以傳統(tǒng)藥物化學(xué)研究方法和手段為基礎(chǔ), 綜合應(yīng)用多種現(xiàn)代技術(shù), 分析鑒定中藥口服后血清中的移行成分, 研究其藥效相關(guān)性，確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并研究其體內(nèi)過程的應(yīng)用學(xué)科[1]。通過中藥血清藥物化學(xué)研究, 確定中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì), 為闡明中藥及其復(fù)方藥效基礎(chǔ)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。細(xì)氈毛忍冬為忍冬屬植物細(xì)氈毛忍冬Lonicera similes Hemsl的干燥花蕾或初開的花(習(xí)稱長(zhǎng)吊子銀花)， 具有清熱解毒之功效，為川產(chǎn)金銀花的

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

細(xì)氈毛忍冬藥材購(gòu)自荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬逾英教授鑒定為 Lonicera similes Hemsl的干燥花蕾。甲醇(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；乙酸(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；甲醇( 美國(guó)天地公司，色譜純)；樂百氏純凈水；乙腈( 美國(guó)天地公司，色譜純）。蘆丁對(duì)照品( 中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080-200707 ) ， 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110753-200413）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀；DAD檢測(cè)器；KQ-500DE超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲波儀器有限公司)；TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); 微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器有限公司)。Sartorius型電子分析天平( 賽多利斯科學(xué)儀器( 北京) 有限公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD大鼠，SPF級(jí)，體重( 200 g±10g)，購(gòu)自于達(dá)碩公司，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK（川）2009-124。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物的制備

取細(xì)氈毛忍冬藥材1kg粉碎，用50%乙醇水浴回流提取3次。減壓回收乙醇制成1g/mL的提取液，冷藏備用。

2.2 細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物供試品的制備及對(duì)照品的配制

取0.5mL的上述提取液，水浴蒸干，加甲醇100mL，溶液過0.45μm微孔濾膜，得供試品試液。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)品0.0050g ，用 95%乙醇溶解，并完全溶解后轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，用95%乙醇定容，配成0.20mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取綠原酸對(duì)照品0.0040g，用50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，配制成0.4mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液。

2.3 空白血清和含藥血清樣品的制備

取SD大鼠，禁食12h（自由飲水），按1mL/100g體重分別灌胃提取液。給藥一小時(shí)后經(jīng)大腿股動(dòng)脈取血，于3000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，用微量移液槍吸取0.4mL含藥血清于離心管中加入1.2mL甲醇，渦旋混勻10min，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液氮?dú)獯蹈杉?00μL色譜甲醇溶解，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液20μL供HPLC分析用。同法制得空白血清供試品。

2.4 色譜條件

色譜柱：Scienhome C18柱（250 mm x 4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm；流動(dòng)相: A( 0.5%乙酸水溶液)，B(乙腈)；流速: 1mL/min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.5 細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物及其含藥血清定性分析

取細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物供試液及含藥血清樣品在相同的色譜條件下行HPLC分析, 建立HPLC圖譜, 比較鑒定其血中移行成分。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

細(xì)氈毛忍冬乙醇提取物、含藥血清及空白血清HPLC色譜圖見圖1。

圖1 樣品HPLC圖

細(xì)氈毛忍冬給藥后檢測(cè)出了8個(gè)血中移行成分，通過保留時(shí)間與紫外吸收光譜圖與體外樣品比較可知3號(hào)（綠原酸），5號(hào)峰為原型成分，經(jīng)口服后可直接吸收入血。其余6個(gè)峰為代謝產(chǎn)物或是應(yīng)激產(chǎn)物。8個(gè)血中移行成分紫外光譜圖見圖2-9。

圖2 特征峰1（tR=8.305min)

圖3 特征峰2（tR=9.832）

圖4 特征峰3（tR=12.645min)

圖5 特征峰4（tR=16.852min）

圖6 特征峰5（tR=19.025min）

圖7 特征峰6（tR=22.852min）

圖8 特征峰7（tR= 24.765min）

圖9 特征峰8（tR=35.618min）

3.2 討論

比較不同波長(zhǎng)下的色譜圖，以280 nm處所得圖譜的色譜峰指紋信息最多，色譜峰形狀和各峰的分離度較好，并且雜質(zhì)峰較少。因此選定280 nm處所得色譜圖進(jìn)行比較。

在不同的血清處理方法中，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇沉淀法處理血清的步驟少且雜質(zhì)峰較少，峰形較好。在給藥一小時(shí)后色譜峰指紋信息最多，故在給藥一小時(shí)后取血。

細(xì)氈毛忍冬所含化學(xué)成分復(fù)雜，主要為有機(jī)酸及黃酮類，在體內(nèi)吸收較差，給血清分析帶來困難，故先濃縮一定倍數(shù)再進(jìn)樣分析。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，方藥的任何功效都有其體內(nèi)直接作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的8個(gè)血中移行成分，應(yīng)該是“清熱解毒”功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，建立這些成分的現(xiàn)代藥理作用與“清熱解毒”的關(guān)系，有助于闡明“清熱解毒”功效的本質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)入血成分進(jìn)行初步分析，僅從數(shù)目的角度進(jìn)行了定性描述，對(duì)入血成分的歸屬應(yīng)當(dāng)采用LC-MS進(jìn)行分析。中藥一般藥效成分復(fù)雜，用某一種化學(xué)成分體內(nèi)的量變規(guī)律很難反映中藥療效的時(shí)間變化過程，難以體現(xiàn)中醫(yī)藥理論體系的整體觀念。嘗試用給藥前后的血清指紋圖譜，從整體上考察體內(nèi)吸收和代謝過程，不只是考察其中的某些化學(xué)成分，亦可對(duì)中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究提供一種新的嘗試。

[1] 王喜軍.中藥及中藥復(fù)方的血清藥物化學(xué)研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化, 2002, 4 (2) : 1.

[2] 四川省衛(wèi)生廳.四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].1987.

[3] 湖南省衛(wèi)生廳.湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].1993.

[4] 貴州省衛(wèi)生廳.貴州省中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].1988.

（責(zé)任編輯: 胡慧玲）

Primary research on serum pharmacochemistry of Lonicera similes Hemsl.

FU Yan-wei, LI Yu-chuan, TUO Yang-ling, TANG Yu, ZHANG Xu//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To screen and identify the medicinal ingredients through the research on serum pharmacochemistry of ethanol extract of Lonicera similes Hemsl.Method:The HPLC fngerprints analytical methods of ethanol extract of Lonicera similes Hemsl. was built up. Serum transitional components were identifed through comparing the fngerprints of ethanol extract, rat serum-containing active components and blank serum.Result:8 transitional ingredients were obtained. Two of them were prototype components, and the others were metabolites.Conclusion:Serum transitional components and the metabolites may be active ingredients that directly work in the body. Further research will be benefcial to explore the material basis of effcacy and action mechanism of Lonicera similes Hemsl.

Lonicera similes Hemsl.; serum pharmacochemistry; transitional ingredients

R 284

A

1674-926X(2014)04-003-02

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2010A036）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

付燕偉（1988-），男，碩士在讀，主要從事中藥化學(xué)和中藥質(zhì)量控制研究Email:969299927@qq.com

張旭（1960-），男，副教授，博士，主要從事中藥化學(xué)和中藥質(zhì)量控制研究

2013-12-10主流品種，種植廣，產(chǎn)量大，在四川、湖南、貴州省中藥材標(biāo)準(zhǔn)中收載[2～4]。近年來對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，化學(xué)成分研究等方面有了更多的報(bào)道，但其體內(nèi)作用成分及代謝過程研究還未見報(bào)道。因此作者采用血清藥物化學(xué)研究方法, 應(yīng)用色譜指紋圖譜分析等手段對(duì)此進(jìn)行了初步探討。