去乙酰化酶抑制劑對乳腺癌細胞周期作用及分子機制的探討

李維前，劉 霞，張守成

（1.徐州醫學院附屬第三醫院病理科，江蘇 徐州 221003；2.徐州市沛縣人民醫院病理科，江蘇 徐州 221600）

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去乙酰化酶抑制劑對乳腺癌細胞周期作用及分子機制的探討

李維前1，劉 霞1，張守成2

（1.徐州醫學院附屬第三醫院病理科，江蘇 徐州 221003；2.徐州市沛縣人民醫院病理科，江蘇 徐州 221600）

目的研究去乙酰化酶抑制劑（MS-275）對乳腺癌細胞（MCF7）周期的作用及機制。方法0.5、1.0、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7細胞24 h，用噻唑藍（MTT）觀察不同濃度MS-275對MCF7細胞的生長抑制作用；流式細胞儀檢測細胞生長及周期；Westernblotting檢測MS-275對乳腺癌細胞周期相關基因的表達。結果1.0 μmol/L濃度的MS-275對MCF7細胞生長有抑制作用并呈現一定的量效關系，1.0 μmol/L濃度以上明顯誘導阻滯乳腺癌細胞MCF7細胞周期，明顯增加p21，p27基因的表達，明顯降低 CCND1、CDK4D基因的表達。結論一定劑量的MS-275抑制乳腺癌MCF7細胞的生長，可通過調控多個細胞周期相關基因誘導乳腺癌細胞細胞周期阻滯，細胞阻滯的發生與p21，p27基因表達的增加及CCND1、CDK4D基因表達的減少相關。

去乙酰化酶抑制劑；細胞周期；基因的表達；乳腺癌細胞

MS-275對乳腺癌細胞周期作用的報告現有報道，本研究主要觀察MS-275對乳腺癌MCF7細胞周期的影響，探討MS-275 對MCF7細胞周期發揮作用的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

MS-275、RPMI-1640、ECL顯色試劑盒購買于北京中杉公司；P21，P27，CyclinD1鼠抗人單抗、抗CDK4多抗購自美國Santa Cruz；流式細胞儀、蛋白垂直電泳儀購買美國Bio-Rad公司；乳腺癌細胞株MCF7由徐州醫學院病理生理教研室提供 。

1.2 細胞培養

將MCF7細胞接種在RPMI-1640培養液（10﹪胎牛血清，青霉素、鏈霉素100U/mL），37℃、5%CO2孵箱內貼壁傳代培養。取對數生長期的細胞處理后分組，實驗組分為0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275。對照組為等濃度的二甲基亞砜（DMSO）。

1.3 細胞生長抑制試驗MTT法檢測細胞抑制率

分組：A組試驗組，分別給予0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用，B組設計為空白對照組。

1.4 流式細胞術（FCM）檢測MCF7細胞周期

MCF7細胞單純用無血清的RPMI-1640培養24 h后，依照設計分組作用24 h，PBS洗滌3次，70%的冷乙醇4℃以下凍存固定24 h，離心后棄乙醇（3000 r/min，10 min），再加入1 mL PBS制成細胞懸液固定后，加入RnaseA酶（終濃度為10 μg/mL），常溫放置30 min，用 50 μg/mL的 PI（碘化丙啶）染色，用流式細胞儀進行MCF7周期細胞檢測。

1.5 Western-blotting檢測P21、P27、CyclinD1、CDK4D蛋白的表達

Western-blotting檢測MCF7腫瘤細胞表面各基因的表達量。

1.6 統計學處理

采用SAS 13.1統計軟件處理，采用REGWQ法對方差分析有顯著性差異的資料進行多組均數間的兩兩比較。設置檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 MS-275對乳腺癌MCF7細胞增殖影響

M T T比色法顯示不同濃度M S-2 7 5處理MCF7細胞24 h后，與溶劑對照組相比，0.5 μmol/L MS-275組細胞的抑制率差異無統計學意義（P＞0.05），1.0 μmol/L MS-275處理的細胞抑制率明顯增加，且隨著MS-275作用濃度升高而作用加強（P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度的MS-275對MCF7細胞增殖的影響（±s，n=6）

表1 不同濃度的MS-275對MCF7細胞增殖的影響（±s，n=6）

注：*與對照組比較，P＜0.05；#濃度組間兩兩比較，P＜0.05

MS-275（μmol/L）抑制率（%）對照組7.2±3.24 0.57.86±0.02 1.020.04±0.31*#1.526.47±0.28*#

2.2 MS-275對MCF7細胞的周期作用

0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7細胞24 h，與溶劑對照組相比較，0.5 μmol/L MS-275處理組細胞的周期無明顯差異，隨著MS-275作用濃度的逐步升高阻滯在G1期的細胞明顯增加（P＜0.05），見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測不同濃度MS-275對MCF7細胞周期的影響

2.3 Western-blotting檢測MS-275處理MCF7細胞P21，P27,CyclinD1、CDK4D的表達變化

圖2 Western-blotting檢測MS-275作用MCF7細胞后P21、P27、CyclinD1、CDK4D蛋白的表達量變化

0.5 μmol/L MS-275、1.0 μmol/L MS-275、1.5 μmol/L MS-275作用MCF7細胞24 h后，與溶劑對照組比較，0.5 μmol/L MS-275處理組細胞p21，p27，CCND1、CDK4D 蛋白的表達量無明顯變化，1.0 μmol/L MS-275處理的細胞p21，p27,蛋白的表達量明顯增加，且隨著MS-275作用濃度的升高而升高（P＜0.05），CCND1、CDK4D蛋白的表達量明顯減少，且隨著MS-275作用濃度的升高而下降（P＜0.05），見圖2。

3 討 論

組蛋白去乙酰化酶抑制劑主要通過控制DNA纏繞在組蛋白的松緊程度來發揮作用，而組蛋白的乙酰化酶和去乙酰化酶主要是通過組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙酰化酶來實現[1-2]。抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞分化、凋亡的途徑失控進而導致細胞發生惡變。組蛋白去乙酰化酶抑制劑可通過提高染色質特定區域組蛋白乙酰化酶，選擇性地恢復腫瘤抑制因子和其它抗癌基因的表達，增強調控細胞凋亡、分化相關蛋白的表達和穩定性，誘導細胞凋亡及分化，成為一類新型的抗腫瘤藥物，研究熱點。MS-275是苯甲酰氨類衍生物（Benzamidesderivative），最近新合成的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑[3-4]，已被證實對部分腫瘤有效應且已應用在臨床實驗中，它能選擇抑制組蛋白去乙酰化，腫瘤細胞作用強，在人體內穩定性好毒副作用相對較小，且使高度酰基化的組蛋白聚集 ，也能通過微生物設計合成，實現抑制細胞分裂 ，間接地抑制血管生成因子的表達，幫助阻斷對腫瘤的血液供應進而誘導腫瘤細胞分化凋亡。

本研究通過實驗證實MS-275 可以抑制MCF7細胞生長，并使 MCF7細胞周期停滯于G0/G1期。并且表明0.5 μmol/L MS-275作用MCF7細胞對細胞生長無顯著影響，抑制率無明顯差異，1.0 μmol/L MS-275作用MCF7對抑制細胞生長周期效應顯著且抑制率顯著增加，表現出一定劑量相關性。p21 和p27是調控細胞周期至關重要的關鍵基因，位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，p21又稱WAF1/CIP1，p27蛋白是CKI中的一種,在真核細胞的細胞周期調控中起著重要的作用,是一種廣譜的周期蛋白依賴激酶抑制劑,主要通過抑制CDK的活性,來阻斷細胞周期中G1、S期的轉換,實現對細胞周期的負調控.同時, 被認為是細胞周期中G1期向前發展的抑制劑。介導了TGF誘導的細胞在G0/G1期的休眠且通過C端與PCNA相互作用，阻斷PCNA活化DNA聚合酶的活性達到抑制DNA的合成進一步使細胞周期停滯，因而被認為是一種抑癌基因。p27基因還參與了細胞分化,器官發育大小、細胞凋亡等重要信號傳導途徑。研究已證實細胞周期進程受到一系列Cyclin D/cdk精密調控，而P21、P27又是這個進程中與Cyclin D/cdk形成緊密結合的關鍵基因。例如，P21結合了cdk就能抑制它的作用，抑制cdk導致的Rb磷酸化，CDK激酶是細胞周期調控中的重要因素，是細胞周期運行的引擎分子。目前發現，至少存在12種CDK激酶，即CDK1至DK12。主要生物學作用是使得細胞由分裂間期向分裂期轉化，分裂間期時內部的轉化并以復合物形式出現[5-9]，同時，P27也能與Cyclin D結合調控細胞的周期變化，其過量表達導致細胞增殖分化紊亂最終惡變，由于組織分化程度差異致使不同腫瘤中陽性檢出率表現不同，在分化較差的腫瘤細胞中表達量較高。在本研究中我們發現 1.0 μmol/L 濃度的MS-275 對MCF7細胞有明顯的抑制生長效應且具有量效關系，1.0 μmol/L濃度之上可顯著阻滯MCF7細胞生長，增強乳腺癌之p21。

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Deacetylase inhibitor to breast cancer mitotic cycle function and molecularmechanism discussion

LI Wei-qian1,LIU Xia1,ZHANG Shou-cheng2
(1. Department of pathology the third affi liated hospital of xuzhou medical college, Jiangsu Xuzhou 221003,China; 2. Department of pathology peixian people’s hospital of xuzhou city,Jiangsu Xuzhou 221600,China)

Objective Study the deacetylase inhibitor MS-275 to the breast cancer MCF7 cell cycle function and the mechanism. Methos 0.5、1.0、1.5 μmol / L MS-275 affects the MCF7 cell 24 hours, observes different density MS-275 with MTT to the MCF7 cell's growth inhibitory action; flow cytometry examination cell growth and the cycle; Westernblotting examine MS-275 to the mammary gland cancer cell cycle related gene expression..Results1.0 μmol/L density MS-275 has the obvious growth inhibitory action to the MCF7 cell, and presents certain quantity effect relations, may induce the mammary gland cancer cell MCF7 mitotic cycle above the 1.0 μmol/L density to hinder obviously, may strengthen the p21, p27 gene obviously the expression, reduces CCND1, the CDK4D gene expression obviously.ConclusionCertain dosage’s MS-275 suppresses breast cancer MCF7 cell’s growth, may through regulate many mitotic cycle related gene induction mammary gland cancer cell mitotic cycle to hinder, the cell hinders occurrence and p21, p27 gene expression increase and CCND1, CDK4D gene expression reduced related.

Deacetylase inhibitor; Mitotic cycle; Gene expression; CDK4D;Breast cancer Cell

R735.1

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