RP-HPLC法測定人血漿中莫西沙星的濃度

黃 娟，雍小蘭，馮仕銀，王藍天，杜曉琳，李 楠（成都軍區總醫院臨床藥學科，成都 610083）

鹽酸莫西沙星為第四代新型喹諾酮類超廣譜抗菌藥物，其抗菌譜覆蓋了全部呼吸道主要致病菌，主要用于慢性支氣管炎急性加劇者、社區獲得性肺炎以及急性細菌性鼻竇炎。莫西沙星具有良好的藥動學特性，口服吸收良好，生物利用度高，具有良好的組織穿透力[1]，目前已廣泛應用于臨床。測定動物和人血漿中的莫西沙星濃度的方法已有報道[2-8]，但本試驗選擇氟康唑為內標，性質穩定、提取回收率高；流動相簡單，不含磷酸緩沖鹽；經液-液萃取樣品干凈，回收率穩定，具有一定的優越性。該反相高效液相色譜（RP-HPLC）法具有操作簡便、準確、靈敏度高、專屬性強、重復性好、試劑便宜等優點，適用于莫西沙星的臨床血藥濃度測定和藥動學研究以及Ⅰ期臨床試驗。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB135-S十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Thermo ST16R型冷凍離心機（美國熱電公司，離心半徑：16 cm）；渦旋混合器（北京踏錦科技有限公司）；－80 ℃低溫冰箱（中國海爾公司）；Turbo Vap LV型濃縮儀（美國Caliper公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸莫西沙星對照品（德國拜耳公司，純度：96.2%，批號：R-1004-01G）；內標：氟康唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：99.9%，批號：100314-200503）；甲醇、乙腈均為色譜純，二氯甲烷、乙醚為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（含0.05%三氟醋酸，22∶78）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：296 nm（0～2.5 min）、256 nm（2.5～4.5 min）、296 nm（4.5～8.0 min）；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μl。在該試驗條件下，莫西沙星與內標能完全分離，不受血漿內源性雜質干擾，莫西沙星與內標的保留時間分別為6.2 min與3.4 min。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+2.0 μg/ml莫西沙星溶液+內標（200 μg/ml氟康唑對照品）溶液；C.給藥后2 h的血漿樣品；1.氟康唑；2.莫西沙星Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+2.0 μg/ml moxifloxacin+200 μg/ml internal standard；C.plasma sample 2 h after medication；1.fluconazole；2.moxifloxacin

2.2 溶液的配制

（1）對照品貯備液：準確稱取鹽酸莫西沙星對照品5.46 mg（相當于莫西沙星5.0 mg）于5 ml量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得莫西沙星貯備液。（2）內標溶液：準確稱取氟康唑對照品40.31 mg于10 ml量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得內標貯備液；取內標貯備液，用甲醇-水（1∶1）稀釋，配制成200 μg/ml的內標溶液，于4 ℃下保存，備用。（3）萃取劑：乙醚-二氯甲烷（3∶2）。

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取血漿200 μl，加入10 μg/ml內標氟康唑溶液100 μl，混勻后加入萃取劑4 ml，渦旋混勻5 min。于3 200 r/min離心10 min，轉移上層有機相于尖底試管中，30 ℃水浴氮氣流吹干。殘渣用甲醇-水（1∶1）100 μl復溶，進樣20 μl。

2.4 線性關系及定量下限考察

取空白血漿配制成含莫西沙星分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μg/ml的系列標準血漿樣品，其余按“2.3”項下方法處理，記錄色譜。以莫西沙星峰面積與內標峰面積的比值（y）與對應濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程：y＝94.02x－0.005（r＝0.999 6）。結果表明，莫西沙星血藥濃度在0.05～10 μg/ml范圍內線性關系良好，定量下限為0.05 μg/ml。定量下限的精密度RSD和回收率分別為1.87%和108.79%（n＝5）。

2.5 精密度試驗

配制莫西沙星為0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3個質量濃度的質控血漿樣本，各6份，按“2.3”項下方法處理，根據當日標準曲線計算日內精密度；連續測定3 d，計算日間精密度，結果見表1。結果表明，本試驗所建立的方法的精密度與準確度均達到試驗要求。

表1 精密度及回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝6）

2.6 回收率試驗

配制莫西沙星為0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3個質量濃度的質控血漿樣本，各3份，按“2.3”項下方法處理，測定所得莫西沙星峰面積與對應質量濃度對照品溶液直接進樣所得峰面積相比，計算提取回收率；根據當日標準曲線求得實測質量濃度，以實測值與理論值相比計算方法回收率，結果見表1。其中，內標的提取回收率為97.31%。

2.7 穩定性試驗

配制莫西沙星為0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3個質量濃度的質控血漿樣本，按“2.3”項下方法處理。分別考察了血漿樣本室溫放置8 h、反復凍融3次以及－80 ℃冷凍放置30 d的穩定性，結果見表2。結果表明，在上述穩定性考察條件下，莫西沙星的質量濃度均保持穩定，未出現明顯變化。

表2 穩定性試驗結果（，n＝3）Tab 2 Results of stability tests（，n＝3）

表2 穩定性試驗結果（，n＝3）Tab 2 Results of stability tests（，n＝3）

2.8 樣品測定

結核性胸膜炎患者靜脈滴注鹽酸莫西沙星注射液400 mg，給藥后0.3、2、4 h時采集前臂靜脈血3 ml，分離血漿，按“2.3”項下方法處理后進樣測定，結果分別為3.16、2.27、1.97 μg/ml。

3 討論

目前血漿中莫西沙星濃度的測定方法主要有高效液相色譜熒光檢測法[3]、高效液相色譜紫外檢測法[4-7]和液-質聯用法[8]。與紫外檢測相比，熒光檢測法的應用范圍較窄，對干擾非常敏感；液質聯用法則成本高。故本試驗采用了RP-HPLC法，選擇氟康唑為內標。因為氟康唑的吸收波長為256 nm，莫西沙星的吸收波長為296 nm，所以采用了分段改變波長的方法進行檢測，二者的分離度符合要求，切換波長不影響檢測。與文獻[2-6]相比，本試驗的流動相簡單，不含磷酸緩沖鹽，莫西沙星出峰時間短，具有一定的優越性。

本試驗選用乙醚-二氯甲烷作萃取劑，不用調酸堿度。與文獻[4-5]中使用的樣本量相比，本試驗所用血漿量更少，從0.5、1 ml減少到0.2 ml。文獻[5]中，健康志愿者單劑量口服400 mg莫西沙星后，血漿峰值濃度為（3.06±0.42）μg/ml，本試驗的定量下限為0.05 μg/ml，能滿足峰值濃度的1/20的要求，可應用于其藥動學和生物等效性研究。

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