HPLC法同時(shí)測(cè)定鎮(zhèn)驚瀉火顆粒中4種成分的含量Δ

許麗雯，奚之駿（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

鎮(zhèn)驚瀉火顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院研制開(kāi)發(fā)的中藥復(fù)方制劑，由甘草、淮小麥、大棗、知母、大黃等藥味組成，臨床用于治療抑郁癥、廣泛性焦慮和精神障礙等多種精神、情志疾病[1-3]。為更全面地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了方中芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚的含量。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1311B型四元泵、G1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A 型柱溫箱、G1314F 型可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；DL-120D 型智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；AG135型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

鎮(zhèn)驚瀉火顆粒（龍華醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)：20120615、20120712、20120726）；芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111607-200402、110795-201007、110756-200110、110796-201118）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak C18（250mm×4.6mm，5μm）；預(yù)柱：Phenomenex C18（4.0mm×3.0mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30min，10%→27%A；＞30～40min，27%→55%A；＞40～60min，55%→90%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1.0ml/min；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μl。

2.2 混合對(duì)照品貯備液的制備

取經(jīng)五氧化二磷干燥48h后的芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為101.8、20.16、10.72、10.24μg/ml，即得混合對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

取鎮(zhèn)驚瀉火顆粒約1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：120W，頻率：40kHz）處理30min，放冷，再次精密稱(chēng)定，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方量分別制備缺知母和大黃的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照樣品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚與樣品中其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，分離度＞1.5；所測(cè)成分理論板數(shù)均不低于10000；陰性樣品無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液1.00、2.50、5.00、7.50ml，分別置于10ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。取混合對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液各適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以混合對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.知母陰性對(duì)照；D.大黃陰性對(duì)照樣；1.芒果苷；2.蘆薈大黃素；3.大黃素；4.大黃酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.Anemarrhena asphodeloides negative control；D.Rheum palmatum negative control；1.mangiferin；2.aloe-emodin；3.emodin；4.chrysophanol

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝4）Tab 1 Linearing relationship（n＝4）

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μl，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚的RSD 分別為0.71%、0.65%、0.73%、0.89%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下的同一批（批號(hào)：20120615）供試品溶液適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果，芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚的平均含量分別為1.1170、0.2153、0.0846、0.0827mg/g，RSD 分別為1.30%、0.97%、1.10%、1.40%（n均為6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下的同一批（批號(hào)：20120615）供試品溶液適量，室溫下放置，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果，芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚的平均含量分別為1.1090、0.2141、0.0839、0.0833mg/g，RSD 分別為0.78%、0.92%、0.89%、1.10%（n均為6），表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同一批（批號(hào)：20120615）樣品6份，每份約0.5g，精密稱(chēng)定，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液（芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚的質(zhì)量濃度分別為0.5645、0.1157、0.0487、0.0434mg/ml），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.11 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批次的鎮(zhèn)驚瀉火顆粒各適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按雙點(diǎn)校正法計(jì)算各成分含量，樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)中芒果苷的分離多用乙腈-0.2%冰醋酸溶液、乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-33mmol/L 磷酸二氫鉀溶液、甲醇-0.4%冰醋酸水溶液等流動(dòng)相體系[4-7]；分離大黃蒽醌苷元?jiǎng)t多用甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液體系[8-10]。本試驗(yàn)參考上述條件進(jìn)行分離，結(jié)果均不理想；后采用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相并作梯度洗脫，各成分的峰形和柱效有明顯改善，所測(cè)成分得到了良好的分離。

3.2 提取溶劑的選擇

在預(yù)試驗(yàn)中，分別采用60%、80%、100%甲醇作為提取溶劑，比較各成分的提取率，結(jié)果顯示，100%甲醇的提取率較高，故選擇其為提取溶劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

芒果苷、蘆薈大黃素、大黃素和大黃酚在254nm 波長(zhǎng)處均有較大吸收，可保證定量的準(zhǔn)確性，故選擇254nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于鎮(zhèn)驚瀉火顆粒的質(zhì)量控制。

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