重組腺病毒TOA02在荷瘤裸小鼠體內(nèi)的生物分布研究Δ

胡 衛(wèi)，張苗旋，鄭崛村，王 玲，沈富兵#（.武漢大學醫(yī)院，武漢 43007；.成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，成都 60065）

溶瘤腺病毒抗腫瘤療法是一種具有較高臨床應(yīng)用前景的新型抗腫瘤模式[1]，其原理在于改造腺病毒載體，使其可以在腫瘤細胞中優(yōu)先復制，而大量復制的腺病毒最終將破壞宿主細胞。這種特異性復制能力的獲得是靠不同的策略達到的，如修飾病毒的包膜蛋白使之高效感染腫瘤細胞[2]；摻入腫瘤啟動子序列以控制病毒基因的表達和清除病毒在正常細胞中復制所必需的基因[3-4]。到目前為止，已經(jīng)有成系列的條件性溶瘤腺病毒在進行臨床前和臨床試驗[5]。

本課題組構(gòu)建的重組腺病毒TOA02即為條件性復制溶瘤腺病毒[6]，主要用于肝癌、肺癌、前列腺癌以及頭頸部癌等多種腫瘤的抗腫瘤治療，對正常細胞沒有影響，是一種新型的抗腫瘤基因治療制品。筆者將開展TOA02 的生物分布實驗，以把握TOA02 在體內(nèi)各組織臟器的分布情況和代謝動力學特點，并考察TOA02 是否擴散到生殖腺和非靶組織中，以便為預測毒性靶器官提供直接證據(jù)。鑒于TOA02只能在人類腫瘤中高度復制，筆者選擇接種人肺癌細胞A549的荷瘤裸小鼠作為實驗載體，通過瘤內(nèi)注射藥物，觀察TOA02 在體內(nèi)的分布情況。本實驗采用定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）檢測法，選用腺病毒殼粒六鄰體（Hexon）基因作為檢測指標。

1 材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱[立德泰勀（上海）科學儀器有限公司]；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；FTC2000 實時熒光定量PCR 儀（加拿大楓嶺公司）；超聲波組織勻漿器（德國IEKA 公司）；ABI PRISM 7000型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 病毒與試劑

TOA02（本課題組自制，批號：20100518，滴度：1.8×1012copies/ml，－80 ℃貯藏）；新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；組織DNA提取試劑盒、實時定量PCR反應(yīng)試劑[寶生物工程（大連）有限公司]。

1.3 移植瘤細胞系和病毒株

人肺癌細胞系A(chǔ)549、巨細胞病毒株AD169、Ⅰ型單純皰疹病毒株KOS、Ⅱ型單純皰疹病毒株HG252 和風疹病毒株M33由華西醫(yī)院移植免疫學實驗室提供，均為ATCC來源。

1.4 動物

2 方法

2.1 腫瘤模型構(gòu)建

2.2 給藥與取樣

根據(jù)臨床擬用劑量設(shè)置實驗組荷瘤裸小鼠給予TOA02 3×1010copies/ml，每只50 μl，瘤體內(nèi)注射，隔日注射1 次，共3次；對照組荷瘤裸小鼠給予等體積生理氯化鈉溶液。于首次給藥后第11、18、36天各取實驗組6只荷瘤裸小鼠（♀各半），腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，取血并摘取組織臟器，順序依次為：血液、睪丸/子宮、附睪/卵巢、脾臟、腎臟、肝臟、肺臟、心臟、腫瘤、骨髓、大腦；對照組僅末次取樣，均于－80 ℃下保存。

2.3 樣品處理與測定

2.3.1 DNA 提取。分別取腫瘤及各臟器組織5～10 mg，剪成約1 mm的碎塊，加入180μl 裂解緩沖液，漩渦混勻后，加20μl蛋白酶K 漩渦混勻，置于55 ℃孵育3 h，于37 ℃過夜，然后按試劑盒說明書分別抽提總DNA。

2.3.2 引物的設(shè)計與合成。Hexon 基因是腺病毒的特異和保守序列，故以其為靶基因。使用Primer Express v 3.0 軟件，以Hexon 基因為模板設(shè)計引物及探針。為了避免DNA 的污染，上下游引物均設(shè)計為跨過內(nèi)含子。Hexon 基因上游引物：5′-CTTCGATGATGCCGCAGTG-3′；下游引物：5′-GGGCTCAGGTACTCCGAGG-3′；探針：5′-FAM-TTACATGCACATCTCGGGCCAGGAC-TAMRA-3′。引物（19 bp）與TaqMan 探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，并經(jīng)基于蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫的相似性檢索工具（BLAST）的相似性比較，期望值E值小于0.01。開蓋前短暫離心，加入經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的重蒸水（ddH2O）稀釋至濃度為10－2nmol/μl，－20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 定量PCR擴增。總體積為30μl，含10×Buffer緩沖液3μl、0.025 mol/L MgCl23μl、0.01 mol/L dNTP 0.9μl、0.01 mol/L上游引物1μl、0.01 mol/L下游引物1μl、0.01 mol/L TaqMan探針1μl、Taq DNA Polymerse（5 U/μl）0.3μl、焦碳酸二乙酯處理過的水14.8 μl、DNA 模板5 μl。擴增條件為：94 ℃1 min；94 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，45 個循環(huán)。在PCR 反應(yīng)過程中，設(shè)定無DNA樣品的空白管為陰性對照。

2.3.4 引物的特異性檢查。分別將AD169、KOS、HG252、M33病毒和TOA02 進行定量PCR 擴增，并使用Primer Express v 3.0 軟件對上下游引物的退火溫度（Tm值）和GC 含量、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯配現(xiàn)象、引物二聚體等進行分析，評價引物的特異性。

2.3.5 標準曲線繪制。用TOA02標準模板樣品（1×108copies/ml）的DNA模板按10倍梯度進行稀釋配制成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/ml 7個濃度梯度，制成標準系列模板，自每個稀釋模板中取樣5μl，分別加至30μl的反應(yīng)體系中，進行實時熒光定量PCR。每個稀釋模板做5 個復孔，根據(jù)獲得的擴增循環(huán)數(shù)（ct值），擬合標準曲線。

2.3.6 精密度檢測。將TOA02 標準模板樣品（1×108copies/ml）的DNA模板用生理氯化鈉溶液稀釋為1×107、1×105、1×103copies/ml 3個濃度梯度，每一濃度樣品做5個復孔。在樣品配制的第1 天，對樣品進行檢測并計算每一濃度樣品的RSD，以考察標準曲線試驗內(nèi)精密度；分別在第1、3、5天檢測并計算樣品的RSD，以考察試驗間精密度。

2.3.7 待測組織目的Hexon DNA copies的測定。將組織提取的DNA樣品各取5μl，加至反應(yīng)體系中，按“2.3.3”項下條件進行PCR擴增。繪制各樣品的動力學曲線并獲得相應(yīng)ct值，通過標準曲線獲取各待測樣品中TOA02的Hexon DNA copies。在PCR反應(yīng)過程中，設(shè)定無DNA樣品的空白管為陰性對照。

2.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 12軟件對數(shù)據(jù)進行直線回歸、方差分析和相關(guān)性分析，P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 引物的特異性

經(jīng)檢測，引物對AD169、KOS、HG252、M33 病毒均無擴增作用，而對TOA02 具有較高的特異性，依據(jù)堿基互補配對原則，Primer Express v 3.0 軟件顯示上游引物、下游引物無非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體形成，上游引物：Tm為54.5 ℃、GC占57.8%，下游引物：Tm為59.4 ℃、GC占68.4%。因此，該引物具有較高的特異性。

3.2 TOA02標準模板的熒光定量PCR標準曲線

經(jīng)動力學曲線確定每個樣品管中熒光強度增加到某一特定閾值（Threshold）時的ct值，即1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copies/ml 的TOA02 標準模板樣品的ct值分別為16.42、20.71、24.76、27.95、30.82，將其與標準模板初始copies 的對數(shù)值作圖，得到該樣品的標準曲線。依據(jù)擬合的標準曲線可知，TOA02標準模板的熒光定量PCR的線性范圍為1×103～1×107copies/ml，最低定量濃度為1×103copies/ml，回歸系數(shù)大于0.96（r2＝0.97），擬合滿意。ct值每減少1 個循環(huán)，對應(yīng)的模板DNA增加倍數(shù)（Y值）的計算公式為：Y＝101/Δct，Δct＝靶DNA每稀釋10倍時平均增加的ct值。本檢測的Y＝1.8。

3.3 精密度試驗結(jié)果

TOA02 標準曲線具有良好的試驗內(nèi)和試驗間精密性，試驗內(nèi)RSD 為1.88%～3.58%（n＝5），試驗間RSD 為1.98%～4.68%（n＝5）。

3.4 待測組織目的Hexon DNA copies的測定結(jié)果

結(jié)果顯示，對照組荷瘤裸小鼠體內(nèi)各腫瘤、血液和組織臟器中均未檢出TOA02 的Hexon DNA copies。實驗組首次給藥后第11天，腫瘤內(nèi)TOA02 的Hexon DNA copies明顯高于血液和其他的組織臟器，其中第18 天腫瘤的Hexon DNA copies 最高，分布量依次為肝臟＞腎臟＞脾臟＞肺臟＞心臟；第18 天后，腫瘤組織中TOA02 的Hexon DNA copies 增高，而血液及各臟器組織的生物分布卻在逐漸減少；至第36天，除腫瘤組織尚能檢出外，血液和其他臟器均未檢出；在實驗過程中骨髓、大腦、睪丸、附睪、卵巢和子宮等組織中均未檢出TOA02 的Hexon DNA copies，結(jié)果見表1（表中“-”表示未檢出）。

表1 2組荷瘤裸小鼠體內(nèi)各腫瘤、血液和組織臟器中Hexon DNA copies（組織：copies/100μg genome DNA，血液：copies/ml，n＝6）Tab 1 DNA copy numbers of Hexon in tumor，blood and organs of tumor-bearing nude mice in 2 groups（tissue：copies/100μg genome DNA，blood：copies/ml，n＝6）

4 討論

生物分布研究是載體類轉(zhuǎn)基因藥物臨床前安全性評價的重要內(nèi)容，其目的在于研究載體藥物在體內(nèi)的分布情況及代謝動力學特點，以考察該載體藥物是否擴散到非靶組織中，特別是生殖腺，并從而預測藥物的毒性靶器官[7-8]。目前常用的載體類藥物的生物分布檢測技術(shù)是實時定量PCR，其能對初始模板序列進行準確定量，具有較高的靈敏度和特異性，而且不需要進行PCR 后續(xù)操作[9]。選擇基因組中特異和保守的靶基因作為載體的生物標簽是定量PCR的重要特征。本研究選用Hexon 基因作為定量PCR 的靶基因，以其copies 來表示病毒顆粒數(shù)。Hexon蛋白是腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其與五鄰體蛋白和纖維蛋白一起構(gòu)成核衣殼，決定著病毒粒子的大小，且?guī)в兄饕膶俸蛠唽偬禺愋钥乖瓫Q定簇和次要的種特異性抗原決定簇[10-11]。

生物分布實驗結(jié)果顯示，TOA02 在腫瘤組織中能良好復制，病毒載體的濃度由11 d（第3次瘤內(nèi)給藥后）的（2 240 541±1 692）copies/100 μg genome DNA增加到18 d的（13 120 285±88 210）copies/100 μg genome DNA，36 d 后仍有（336 453±23 415）copies/100 μg genome DNA的高含量。由于腫瘤細胞中有大量病毒體增殖，病毒體隨之播散入血并進入全身各組織中。但筆者發(fā)現(xiàn)，這種分布是機會性和一過性的，因為病毒體是分布在血液循環(huán)較為豐富的臟器，如肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、心臟等，而骨髓、大腦、生殖腺等并沒有分布；而且，隨著時間推移，在腫瘤中病毒含量降低時，滯留在這些臟器中的病毒體也被清除了。由此可見，TOA02在體內(nèi)應(yīng)用，特別是瘤體給藥是安全的。這主要與TOA02的作用機制有關(guān)，因為TOA02是端粒酶活性和Rb途徑缺失特異性的，特別是其啟動子上的E2F-1 結(jié)合位點的作用加強了hTERT 啟動子載體在hTERT（+）、Rb（－）腫瘤細胞中啟動作用，而在hTERT（－）、Rb（+）的正常細胞中表現(xiàn)出啟動抑制作用，因而使得其在正常細胞中幾乎不能復制[6]。

由于只有在端粒酶高活性或Rb途徑缺失的細胞中才能復制和增殖，TOA02 在非腫瘤模型的正常動物體內(nèi)的組織細胞中不能增殖，靜脈給予后會很快被機體免疫系統(tǒng)清除，應(yīng)該不會有可檢測到的生物分布；但其能否在組織增生活躍的臟器如生殖腺中復制和滯留，有待進一步通過TOA02 在恒河猴中的生物分布實驗來證實。

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