2 種米曲霉發酵醬油風味物質比較

趙國忠，姚云平，曹小紅，陳 衛,*

（1.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.天津科技大學 教育部食品營養與安全重點實驗室，天津 300457）

2 種米曲霉發酵醬油風味物質比較

趙國忠1，姚云平1，曹小紅2，陳 衛1,*

（1.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.天津科技大學 教育部食品營養與安全重點實驗室，天津 300457）

為進一步比較傳統菌株米曲霉滬釀3.042和前期實驗誘變菌株米曲霉100-8釀造醬油的差異。通過高效液相色譜、氣相色譜-質譜聯用儀比較醬油中有機酸、氨基酸和風味物質成分的差異。通過發酵終期醬油有機酸的結果比較發現：米曲霉100-8發酵 的醬油中蘋果酸含量增加，檸檬酸和琥珀酸含量下降。通過醬油發酵在大曲階段和后期階段的氨基酸比較發現，使用米曲霉100-8菌株發酵的醬油大曲及其后期發酵為醬油階段，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸這3 種氨基酸含量都明顯升高。這些有機酸和氨基酸含量之間比例的差異性是造成醬油風味不同的原因之一。對風味物質成分的分析發現：與對照相比，米曲霉100-8發酵的醬油中醇、醛、酸和吡嗪類物質都有所增加，其中風味物質增多最明顯的是吡嗪類。通過米曲霉100-8釀造的醬油與傳統米曲霉滬釀3.042比較，其有機酸、氨基酸和風味物質都有明顯的不同。

米曲霉；醬油；有機酸；氨基酸；風味物質

醬油[1]是一種在亞洲國家盛行的具有咸味和獨特風味的大豆類傳統發酵調味品。醬油的消費市場目前也正在從亞洲國家走向西方市場，在世界各地廣泛使用，并逐步實現了醬油的國際化。醬油幾乎是中國每家每戶佐餐的必需品，擔當著基礎調味料的重要角色。中國每年的醬油產量超過500萬 t，占世界總產量的55%以上[2-3]。醬油是由豆粕和麩皮（或大豆和小麥）的混合原料通過米曲霉制曲發酵，后期 添加酵母和乳酸菌厭氧發酵，再用鹽水淋洗而成的。發酵而成的醬油，經過復雜的生物化學作用，具有其獨特的風味，營養價值豐富。

醬油風味的形成是一個極為復雜的、有微生物參與的過程，它的形成需要一些必須的化合物，如游離的氨基酸、水溶性肽及美拉德反應產物[4-6]。這些風味化合物主要來源于碳和氮的代謝。隨著功能性食品的發展，最近幾年人們越來越關注醬油中功能因子的研究，醬油中的許多風味化合物即具有很好的功能特性，包括抗氧化[7-9]、抗癌[10]、降壓[11]、抗菌[12]、抗血小板聚集[13]、抗白內障[14]和抗過敏原的功能特性。醬油同樣可以被視為是一種功能性食品。關于醬油風味的研究正是目前研究的重點，而風味的形成與發酵微生物有息息相關的聯系。本研究通過傳統米曲霉滬釀3.042和誘變菌株米曲霉100-8的風味物質成分的比較分析，為醬油風味物質成分的形成代謝途徑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕和麩皮均為天津市利民調料有限公司提供。

甲醇、乙酸、乳酸、丙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸（均為色譜純） 天津市科密歐化學試劑開發中心。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀、QP2010plus氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；固相微萃取 上海市實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 三角瓶種曲

用接種環挑取3 環米曲霉孢子于滅菌麩皮（含質量分數50%水）中，混勻，30 ℃堆積培養。培養大約15 h第1次搖瓶，將培養基平鋪，30 ℃繼續培養8 h第2次搖瓶，繼續平鋪培養。變綠后扣瓶培養直至全部變綠。然后將其裝入牛皮紙袋中，50 ℃烘干6 h左右，種曲制成。1.3.2 竹匾大曲

接種質量分數0.3%的種曲于滅過菌的大曲培養基（m（豆粕）∶m（麩皮）=6∶4），混勻后堆積培養，濕布蓋好，30 ℃恒溫培養。約15 h后第1次翻曲，30 ℃平鋪培養8 h以后，直到大曲培養基全部變白色，第2次翻曲后繼續平鋪培養。培養到種曲培養基變為黃綠色，大曲即制成。

1.3.3 低鹽固態發酵

將大曲按照原料質量比1∶1的比例，拌入50 ℃左右鹽度為質量分數12%的鹽水，入缸壓實，表面鋪上塑料隔絕氧氣，40 ℃發酵10 d，35 ℃發酵20 d即可。

1.3.4 有機酸測定液相色譜條件

稱取10 g大曲或醬醪裝入100 mL的三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，煮沸5 min，過濾，然后用100 mL容量瓶定容，再用C18萃取小柱過濾，進樣針吸取20 μL樣品進樣。

液相色譜柱：HydrospHere C18柱（250 mm× 4.6 mm）；流動相：0.02 mol/L KH2PO4；流速0.5 mL/min；進樣量20 ?L；紫外檢測器檢測波長215 nm；柱溫30 ℃。

1.3.5 氨基酸測定液相色譜條件

樣品處理方法同1.3.4節。液相色譜柱：ODS HYPERSIL柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相和B相梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；紫外檢測器檢測波長338、262 nm；柱溫40 ℃。

流動相A相：8.0 g結晶乙酸鈉1 000 mL水溶解，再加入225 μL三乙胺，攪拌并滴加體積分數5%醋酸調節pH值為7.2，加5 mL四氫呋喃混合。

流動相B相：12.0 g結晶乙酸鈉400 mL水溶解，滴加體積分數5%醋酸調節pH值為7.2，加入800 mL乙腈和800 mL甲醇混合。

1.3.6 固相微萃取-氣相色譜-質譜條件

固相微萃取技術可以在一定程度上檢測出醬油中的可揮發性物質的成分和相對含量[15]。使用方便，易操作。分別稱5 g大曲和醬醪于頂空瓶中，擰好瓶蓋，于50 ℃水浴中平衡30 min，將固相微萃取針插入頂空瓶中吸附30 min，然后進行氣相色譜-質譜測定。

氣相色譜條件：色譜柱：VF-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持30 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升到250 ℃，保持6 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣量0.5 ?L；分流比5∶1。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度220 ℃；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍m/z 43～500。

分析方法：惠普化學工作站軟件對照NIST 05庫進行數據收集，譜庫初步鑒定物質成分，結合保留時間、質譜、試劑成分和保留指數定性。面積歸一化法相對定量。

2 結果與分析

2.1 大曲和醬油中主要有機酸測定

表1 醬油中各有機酸含量Table 1 Contents of organic acids in soy sauce g/100 mL

米曲霉100-8是經過米曲霉3.042菌株誘變而來的菌株，米曲霉100-8菌株分泌蛋白酶的能力比米曲霉3.042菌株強。2個菌株發酵的醬油風味也不同。因此，分別對不同培養時間段（24、30、36 h）的醬油發酵大曲和后期階段的醬油的有機酸含量進行測定[16]。經測定發現大曲中的有機酸含量極微，很難檢測出來，醬油中的有機酸產生比較明顯。依據有機酸出峰時間、峰面積和標準曲線回歸方程的方法計算醬油中各有機酸含量。結果如表1所示。

由表1可以看出，發酵終期米曲霉100-8發酵的醬油中酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸和丙酸的含量都增多，而檸檬酸和琥珀酸的含量減少。蘋果酸和檸檬酸在食品中是2 種重要的酸類物質。在大多數水果比如蘋果、桃、菠蘿、甜瓜、西瓜、葡萄和西紅柿中，蘋果酸含量較高，通常與檸檬酸一起組成了水果中的主要酸類物質[17]。不同的水果中這2 種酸的比例的不同，也導致了其風味口感的不同。琥珀酸作為食品中的添加劑，可以增強食品風味[18]。目前未見到在米曲霉中酒石酸的生成途徑，在其他物種比如植物中酒石酸有的是由抗壞血酸經過酶的作用轉化生成的，在豆科植物中，酒石酸也可由D-葡萄糖轉化生成[19]。檸檬酸、蘋果酸和酒石酸主要是食品中酸味成分的主要來源，構成了食品中的酸性口味[20]。

結合米曲霉發酵過程中的三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）途徑，蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸 的產生主要由TCA循環途徑產生（圖1）。根據轉錄組數據[21]也發現在TCA循環的上游通路中，烏頭酸梅和異檸檬酸脫氫酶表達上升了2 倍以上（用圓形表示），其他酶上升也較為明顯（用五角星表示），由于這些酶的表達升高，促進了檸檬酸和琥珀酸的降解，導致這2 種酸的下降，而蘋果酸處于TCA循環的下游。上游中酶表達量的增大促進了下游蘋果酸合成的增多。轉錄組數據同樣觀察到丙酮酸脫羧酶的增多，直接促進下游循環草酰乙酸含量的增大，而蘋果酸脫氫酶的表達下降（用三角形表示）。蘋果酸在草酰乙酸的上游，正是下游草酰乙酸的增多，蘋果酸脫氫酶的降低，上游檸檬酸和琥珀酸的減少這兩方面的雙重作用使得蘋果酸含量增多。米曲霉100-8糖酵解途徑中丙酮酸的產生增加，當加入鹽水進入后期厭氧發酵以后，導致丙酮酸在酶的作用下生成的乳酸較多。轉錄組分析結果和發酵實驗中的結果相吻合。

圖1 酸類物質在TCA循環中的代謝通路[[2211]]Fig.1 Acid metabolism in TCA cycle[[2211]]

2.2 大曲和醬油中氨基酸的測定結果

通過對大曲中不同時間段的氨基酸含量的測定[22]，如圖2A所示，橫軸以上柱狀圖表示米曲霉滬釀3.042發酵的大曲所測氨基酸的含量，橫軸以下柱狀圖表示米曲霉100-8發酵大曲所測氨基酸含量。其中，谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和精氨酸在米曲霉100-8發酵大曲中有較為明顯的升高。由圖2B可知，在米曲霉100-8發酵的醬油中，谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、精氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸的含量有所增高。

圖2 大曲（A）及醬油（B）中氨基酸的含量比較Fig.2 Comparison of amino acid contents in soy sauce and koji

綜上所述，米曲霉100-8發酵醬油中呈鮮味的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸含量都增多；呈甜味的氨基酸：脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸含量增多；呈苦味的氨基酸：蛋氨酸、精氨酸、異亮氨酸含量也相應的增多。氨基酸的含量是醬油風味的一個指標，不同的氨基酸會形成不同的口味，在生產中提高產品氨基酸的含量可以直接提高醬油的風味。

2.3 大曲和醬油中香氣成分的測定

圖3 大曲和醬油中風味香氣成分總量比較Fig.3 Comparison of total contents of flavor components in soy sauce and koji

通過對相同質量的大曲和醬油的分析（圖3）可以看出，醬油中的總含量遠大于大曲中的風味總物質含量，可見醬油的釀造過程是其風味物質不斷形成積累的過程。

對發酵醬油的香氣成分分析結果如表2所示。利用氣相色譜-質譜聯用檢測到醬油中的風味物質種類都超過55種，主要包括酯類、醇類、醛類、酸類、酮類、吡嗪、呋喃和酚類等。

表2 香氣成分測定比較分析Table 2 Comparative analysis of flavor components

續表2

圖4 醬油中部分風味成分物質的比較Fig.4 Comparison of flavor components in soy sauces fermented by the two strains

由醬油中風味物質的變化（圖4）可以看出，米曲霉100-8發酵的醬油中吡嗪類物質、醇類物質、醛類物質和酸類物質的含量增加較明顯。酯類物質變化不明顯，含量稍微有所下降。吡嗪類峰面積增大6.9 倍，酸類物質增大1 倍，醇類和醛類物質都增大0.31 倍。醛類物質含量的增加在一定程度上促進了醇類物質的產生。米曲霉100-8發酵醬油比米曲霉滬釀3.042發酵的醬油增多了11 種醇，分別為：2,6-二甲基-4-庚醇、2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環己醇、桉葉油醇、Z-4-十二烯醇、2,2-二甲基丙基環己醇、3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇、順-3-壬烯-1-醇、順-9-萘烷醇、1-十三烷醇、反-2-甲基環戊醇和2-己基-1-葵醇。酸類、醇類、醛類物質的增多，證明由米曲霉100-8發酵的醬油中，基礎風味物質成分有所增加。

在米曲霉100-8發酵的醬油中，吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪被發現。此外，2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪類含量上升較為明顯，對醬油風味影響巨大。吡嗪類物質具有強烈的香氣，而且其香氣的透散性好，對香氣具有獨特的顯著貢獻[23-24]。吡嗪類物質也是加熱食品中所具有的比較典型的香味成分，可以賦予其獨特的焙烤和堅果風味。吡嗪類物質可以由美拉德反應產生[25]。主要美拉德反應的作用下葡萄糖和蛋白質反應生成3-脫氧葡糖醛酮，3-脫氧葡糖醛酮和氨基酸進一步反應生成希胺醇，最終得到吡嗪類化合物。

3 結 論

通過對米曲霉滬釀3.042和米曲霉100-8發酵大曲和醬油的有機酸、氨基酸和香氣物質成分的測定，發現2 種菌株發酵產生醬油的不同風味物質，找到了米曲霉100-8的優勢。通過高效液相色譜分析發現由于米曲霉100-8糖酵解代謝酶類物質的增加，生成了較多的丙酮酸，進入TCA循環以后，根據代謝酶的升高和降低，分析了部分有機酸的含量變化。醬油中氨基酸總量的提高對醬油品質和風味都有好處。通過氣相色譜-質譜聯用儀測定醬油香氣物質的比較，發現米曲霉100-8發酵醬油產生的酸類、醇類、醛類、吡嗪類物質增多比較明顯，對醬油的風味影響較大。其中變化最明顯的是吡嗪類物質的增多，該類化合物主要是由美拉德反應生成的。

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Comparison of Flavor Compounds in Soy Sauces Fermented by Two Aspergillus oryzae Strains

ZHAO Guo-zhong1, YAO Yun-ping1, CAO Xiao-hong2, CHEN Wei1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The contents of organic acids, amino acids and fl avor components in soy sauce fermented by Aspergillus oryzae 3.042 were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) in comparison to those of soy sauce fermented by A. oryzae 100-8, a mutant strain. The organic acids, amino acids and fl avor components at the end of low-salt solid soy sauce fermentation by A. oryzae 3.042 and 100-8 strains were measured. The content of malic acid in soy paste fermented by A. oryzae 100-8 was increased, while citric acid and succinate were decreased. The contents of asparagic acid, glutamic acid and arginine were increased in fermented koji and soy sauce. The taste of soy sauce was also infl uenced by different ratios between organic acids and amino acids. The contents of alcohols, aldehydes, acids and pyrazines in soy sauce fermented by A. oryzae 100-8 were enhanced. More pyrazines were detected in soy paste fermented by A. oryzae 100-8. These results seem to provide a theoretical basis for the soy sauce industry.

Aspergillus oryzae; soy sauce; organic acids; amino acids; fl avors

TS264.2

A

1002-6630（2014）24-0249-05

10.7506/spkx1002-6630-201424048

2014-08-24

江蘇省自然科學基金青年科學基金項目（BK20140146）；第55批中國博士后科學基金面上資助項目（2014M551503）

趙國忠（1983—），男，講師，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：zhaogz@jiangnan.edu.cn

*通信作者：陳衛（1966—），男，教授，博士，研究方向為功能性微生物學。E-mail：chenwei66@jiangnan.edu.cn