變性梯度凝膠電泳法初步解析茯磚茶渥堆發酵過程中細菌群落結構

劉石泉，胡治遠，趙運林,*

（1.湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南 益陽 413000；2.湖南農業大學生物科學與技術學院，湖南 長沙 410128）

變性梯度凝膠電泳法初步解析茯磚茶渥堆發酵過程中細菌群落結構

劉石泉1,2，胡治遠1，趙運林1,*

（1.湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南 益陽 413000；2.湖南農業大學生物科學與技術學院，湖南 長沙 410128）

為解析茯磚茶渥堆發酵過程中細菌群落結構和種類，對渥堆過程中不同時間段細菌16S rDNA 的V3可變區進行擴增，對細菌變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）圖譜中條帶進行克隆、測序和序列比對。結果表明：黑毛茶在渥堆過程中以渥堆24 h為分界點，前后各自細菌群落結構相似，但前后的差異較大；從16S rDNA 的V3可變區比對結果證明黑毛茶渥堆過程中有諾卡氏菌屬、新鞘脂菌屬、短波單胞菌屬、韋龍氏假單胞菌屬、突那梭菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬及不可培養的ε-變形菌、腐敗螺旋菌屬、黏球菌屬、根瘤菌屬和未知分類地位的不可培養細菌6 種。采用DGGE指紋圖譜能更全面、更真實地反映黑毛茶渥堆發酵過程中細菌群落的結構和多樣性變化。.

茯磚茶；渥堆發酵；變性梯度凝膠電泳；細菌群落結構

茯磚茶是傳統黑茶中保健功效最為顯著的品種之一，據《明史·茶法》記載，早在明嘉靖三年即公元1 524年前，茯磚茶就被規定為運往西北供少數民族所需的官茶。茯磚茶與綠茶、紅茶比較，綠茶屬非發酵茶，紅茶屬半發酵茶，而茯磚茶屬于后發酵茶，其加工工藝獨特，獨具菌花香[1]。茯磚茶加工比較特殊，經黑毛茶拼配、篩分、渥堆、汽蒸壓制、發花、干燥、成品包裝等加工工序，加工成茯磚茶產品。以前主要銷往邊疆少數民族地區，專供新疆、青海、甘肅、寧夏等邊疆少數民族地區人民飲用，鑒于茯磚茶的功效被普遍認可和接受，發展前景廣闊，目前正走向內地和國際市場。

茯磚茶加工過程中渥堆處理被認為是形成其獨特風味和功效的關鍵工序，渥堆過程中的微生物作用是在茯磚茶品質形成過程中起著決定性的作用因素之一，雖然不同花色品種所采用的渥堆技術條件不盡相同，但目的都是通過一定程度的發酵，形成葉色黑潤、味醇和、香氣純正、湯色黃紅明亮的品質特征，實際上就是在微生物及濕熱的作用下使以茶多酚為主的化學成分發生一系列的化學變化，研究渥堆過程中微生物種類和結構，對于茯磚茶優異品質的形成和渥堆工序的革新具有重要意義[2-4]。許多學者已經對茯磚茶加工中微生物種類、微生物對茯磚茶品質的影響作了大量研究并取得了重大進展[5-6]，文獻檢索表明茯磚茶在渥堆過程中微生物研究主要集中在真菌，如曲霉、青霉等，而細菌的研究則主要集中在細菌的計數統計上，曾經有報道在渥堆初期有無芽孢小桿菌、芽孢細菌、金黃色葡萄球菌等，這些渥堆中特有的細菌研究，主要是用傳統的微生物培養、分離、鑒定方法研究其菌落組成，對整個發酵流程的不同工藝過程中的優勢菌和非優勢菌共同組成的渥堆中特有的微生物群落結構的研究是零碎的、不系統的，沒有對整個渥堆發酵過程中細菌做動態跟蹤研究。

近年，很多研究者將免培養分子生物學技術應用到微生物群落結構的分析中，聚合酶鏈式反應變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等基因指紋圖譜技術由于快速、直觀、準確等優勢而被逐漸運用于多種傳統發酵食品中[7]。應用PCR-DGGE 技術能檢測群落中90%～99%的微生物物種，無論該物種細胞處于哪種生理狀態（活細胞、死細胞、不可培養狀態的活細胞）[8]。

本實驗主要采用PCR-DGGE及克隆技術，對益陽茶廠有限公司茯磚茶生產線上渥堆過程中不同渥堆階段的黑毛茶樣本進行細菌群落結構和種類分析，并對DGGE圖譜進行聚類分析，同時對渥堆過程中細菌DGGE圖譜中主要條帶進行克隆測序，鑒定其細菌類群，以期能為茯磚茶渥堆微生態研究提供更多信息，以利于更好地研發這一特色產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益陽茶廠有限公司茯磚茶生產線，渥堆過程中分別取渥堆0、8、16、24、32、40、48 h的茶葉樣品，用上、中、下3 層分層獨立取樣后，經四分法逐步縮分至500 g左右，置于-20 ℃冰箱保存，對應編號為W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7，采樣時間為2013年3月28日-30日。

338F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）、GC-338F（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGG CGG GGC GGG GGC GCG GGG GG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）引物由北京美億美生物技術有限公司合成；擴增試劑購自北京美億美生物技術有限公司；DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit 美國Omega公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PTC220型PCR儀、Gel-Doc XR凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；DGGE-2401變性梯度凝膠電泳儀 美國C.B.S.Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌基因組提取

采用CTAB/SDS方法提取樣本細菌基因組DNA[9]，DNA的TE溶液用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品后于-20℃冰箱保存。

1.3.2 細菌16S rDNA片段的PCR擴增與回收

以基因組DNA為模板、采用通用引物GC-338F和518R擴增16S rDNA 的V3高變區序列[10-11]。

PCR擴增體系（50 μL）：10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、GC-338F（20 mmol/L）1 μL、518R（20 mmol/L）1 μL、模板DNA 100 ng、ddH2O補充至50 μL。

PCR擴增程序：94℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復性30 s、72 ℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min。

PCR產物采用DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.3.3 PCR產物的變性梯度凝膠電泳

取10 μL PCR的產物進行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、8%的聚丙烯酰胺凝膠（化學變性劑為100%尿素7 mol/L和體積分數40%的去離子甲酰胺）在1×TAE緩沖液中150 V、60 ℃電泳4 h，DGGE完畢后采用銀染法染色顯色。

1.3.4 DGGE凝膠條帶回收測序

用滅菌的手術刀切下待回收DGGE條帶，采用Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶。以2 μL回收產物為模板，338F/518R為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）為：10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、338F（20 mmol/L）1 μL、518R（20 mmol/L）1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O補充至50 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、55℃復性30 s、72 ℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min。

將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到pEASY-T載體上，并轉化至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，由北京美億美生物技術有限責任公司對插入的細菌16S rDNA片段進行序列測定。

1.3.5 序列片段分析

將序列提交到GenBank數據庫，使用BLAST程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列[12]。

1.4 分析方法

利用分析軟件Quantity One 4.2.3對DGGE圖譜進行聚類和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

多樣性指數H在生態學中它被用來描述生態系統中的生物多樣性，H=-∑PilnPi，式中Pi是第i種在總體中的個體比例；均勻性指數E是實際觀察的物種多樣性指數與理論上最大的物種多樣性指數之比，E=H/Hmax，式中H為實際觀察的物種多樣性指數，Hmax為最大的物種多樣性指數，Hmax=lnS，豐度指數S表示生態系統中物種的數目，具體計算方法參見文獻[13-14]。

利用DNAstar軟件包中的SeqMan程序將DNA 序列進行人工校對，并將所有校對后的序列方向統一為正向，通過在NCBI數據庫進行BLAST檢索，根據比對結果獲得序列對應的細菌種屬信息。

2 結果與分析

2.1 樣本基因組DNA提取

采用CTAB/SDS方法提取樣本基因組DNA，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），說明成功獲得了W1～W7樣本基因組DNA。

圖1 樣本中提取的細菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA extracted from samples

2.2 細菌16S rDNA的PCR擴增

以GC-338F和518R為引物擴增16S rDNA序列、經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約200 bp的預期DNA片段（圖2），用于DGGE分析。

圖2 PCR擴增的16S rDNA部分序列瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products from partial 16S rDNA sequence

2.3 PCR產物的DGGE分析

圖3 不同渥堆發酵階段細菌16S rDNA-PCR產物DGGE圖譜Fig.3 DGGE map of bacterial 16S rDNA-PCR products from different pile-fermentation stages

表1 不同渥堆發酵階段細菌群落特征Table 1 Bacterial community characteristics of samples in different pile-fermentation stages

樣品細菌種群的16S rDNA的PCR產物經DGGE分析結果如圖3所示。茯磚茶渥堆過程中，16S rDNA的V3高變區序列類型十分豐富，表1表明多樣性指數H在開始渥堆的8 h之內稍有提高，隨后下降，渥堆24 h后下降到最低2.501，之后開始回升。均勻性指數E指數變化不大，豐度指數S變化趨勢跟多樣性指數H變化對應，先降后升，在24 h時最低（13）后開始緩緩回升并穩定在16，這可能是由于在茯磚茶渥堆發酵過程中，黑毛茶最先所處的環境是自然狀態，渥堆開始后濕熱作用促使黑毛茶附生的各種細菌相繼開始萌動。多樣性指數H在開始渥堆的8 h之內逐漸提高，細菌的活動無疑會改變渥堆環境如濕度、溫度、含氧量等，同時細菌間的相互生長影響，如拮抗、促生等關系，多樣性指數H稍微有所下降，細菌群落結構的調整逐漸向適應這時渥堆的濕熱環境轉變，加上其他微生物的代謝影響，使適應渥堆環境的細菌開始重新構建黑毛茶渥堆細菌群落結構。

圖4 不同渥堆發酵階段PCA分析Fig.4 PCA analysis of samples in different pile-fermentation stages

由圖4可知，W1、W2、W3主要分布在第四象限，而W5、W6、W7主要分布在第二象限，W4則單獨列于第一象限，說明在黑毛茶渥堆的0～16 h與32～48 h，渥堆細菌群落結構是不相同的，其轉折點是在渥堆24h（W4）的時候。

圖5 不同渥堆發酵階段進化樹Fig.5 Evolutionary tree for different pile-fermentation stages

由圖5可知，W1、W2、W3和W5、W6、W7的相似性較近，而W4則與它們的差異較大，說明了黑毛茶在渥堆過程中，以渥堆24 h為分界點，前后細菌群落結構的變化較大。

2.4 DGGE凝膠條帶回收測序及序列分析

PCR產物純化后連接到pEASY-T載體上，轉化至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆測序。測序結果遞交GenBank數據庫，并進行序列比對，得到條帶所代表的細菌類型。每個回收條帶選取3 個克隆，編號band1、band2、band3 band20表示圖3中位置1～20條帶進行了序列測定，將序列提交到GenBank數據庫，使用BLAST程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列如表2所示。在比對出的細菌種類中，變形菌門（Proteobacteria）9 株、厚壁菌門（Firmicutes）3 株、放線菌門（Actinobacteria）1 株、擬桿菌門（Bacteriodetes）1 株。

表2 DGGE凝膠條帶回收序列分析結果Table 2 Sequence analysis of the recovered DGGE gel bands

用軟件MEGA5[15]對16S rDNA 的V3高變區序列和GenBank中相關種屬代表菌株的16S rDNA序列構建系統進化樹，結果如圖6所示。

圖6 20個條帶建立的進化樹Fig.6 Evolutionary tree for 20 bands

3 討 論

關于黑茶渥堆發酵中細菌的研究，茯磚茶中只是涉及到了在渥堆中有大量的細菌存在[15]，具體鑒定到種及種的渥堆全過程變化卻鮮有研究。但在普洱的渥堆中已有初步研究，如李晨晨等[16]對普洱茶渥堆發酵過程中嗜熱細菌的分離和鑒定研究；姚靜等[17]對普洱茶渥堆發酵過程中細菌種群的分離與分子鑒定研究；樊竹青等[18]對普洱茶渥堆過程中細菌數量的變化研究等主要是應用平板培養分離進行計數或進行鑒定。本次實驗采用PCRDGGE技術，通過DNA序列比對，監測到了渥堆全程不同時段的細菌群落結構和種類。

茯磚茶與普洱同屬于后發酵茶系列，但從用平板培養分離進行鑒定的結果來看，姚靜等[16]發現普洱茶渥堆發酵過程中主要存在7 個不同屬的細菌，分別是芽孢桿菌、克雷伯氏菌、鞘氨醇桿菌、短桿菌、紅球菌、假單胞菌、鮑曼不動桿菌。李晨晨等[15]分離了凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、熱嗜淀粉芽孢桿菌、喜熱噬油芽孢桿菌、乳酸片球菌，植物乳桿菌等。本次渥堆過程中檢測發現了類似的細菌，如假單胞菌、克雷伯氏菌、乳桿菌等，說明這些細菌在黑茶渥堆過程中是較為普遍存在的。通過16S rDNA序列比對也發現了諾卡氏菌、新鞘脂菌、短波單胞菌、突那梭菌、變形菌、腐敗螺旋菌、黏球菌、根瘤菌以及未知的不可培養細菌的存在，說明茯磚茶與普洱茶分別屬于不同的發酵生態系統。而且由圖3可知，條帶7、13、17和19為渥堆過程中的優勢細菌，將條帶的16S rDNA 的V3高變區序列提交到GenBank數據庫，在GenBank中使用BLAST程序進行同源性比較，條帶7為韋龍氏假單胞菌屬（Pseudomonas veronii）、條帶17為克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）XC-08、條帶13和19為不可培養細菌，更說明我們對黑毛茶渥堆發酵中細菌的作用的了解還只是冰山一角。

本實驗分離得到細菌產生的各種活性物都具有較為明顯的作用，有些放線菌等能產生大量茶多酚、氨基丁酸等對人體健康有益的物質，如本次檢測到的諾卡氏菌[19]實驗證明能分泌生物活性物，能顯著增強機體免疫功能，具有抗病原微生物感染及明顯的抑瘤作用，假單胞菌屬[20]、新鞘脂菌[21]屬能降解呋喃丹，短波單胞菌能產L-脯氨酸[22]，植物乳桿菌[23]生長溫度范圍為10～53 ℃，耐酸，最適pH值為5.0，在更低pH值也可以生長，其代謝可產生有機酸，此外還能產生多種酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。細菌對茯磚茶發酵過程中pH值變化及茶葉風味和品質的形成起著重要作用。

本實驗也發現了克雷伯氏菌、短波單胞菌、假單胞菌和黏球菌等，姚靜等[16]也曾在普洱茶中分離了類似細菌。通常被認為這些細菌是條件致病菌，可感染人和動物使其患病，能在茯磚茶渥堆發酵過程樣品中被檢出，說明它們在茯磚茶發酵過程中肯定有一定作用，但所起到的具體作用機理、作用大小有待進一步研究。

本實驗通過PCR-DGGE技術對黑毛茶渥堆發酵中不同時間段的細菌群落結構進行分析，發現不同渥堆時間段細菌群落結構不相同，尤其以渥堆前半段和后半段細菌群落結構差異相對較大，以渥堆24 h為分界點，前后細菌群落結構的變化較大。通過16S rDNA 的V3高變區序列和GenBank中相關種屬代表菌株的16S rDNA序列比對，證明細菌種類比較豐富，共檢測到在黑毛茶渥堆過程中存在諾卡氏菌屬、新鞘脂菌屬、短波單胞菌屬、韋龍氏假單胞菌屬、突那梭菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬和不可培養的腐敗螺旋菌屬、黏球菌屬、根瘤菌屬、ε-變形菌等，同時還發現了6 種不可培養細菌，研究文獻發現這些細菌在傳統培養方法中都未曾檢出，因此采用DGGE指紋圖譜更全面、更真實地反映黑毛茶渥堆發酵過程中細菌群落的結構和多樣性變化，同時也說明要全面準確地了解黑毛茶渥堆發酵細菌多樣性，除了傳統分離培養，更需要先進的分子手段，在利用現代分子技術解析黑毛茶渥堆發酵細菌結構的基礎上，進一步對細菌區系及其相互協同制約的代謝機制的分析和探討，以期揭開細菌與茯磚茶風味形成之間的神秘面紗。

由于茯磚茶加工過程中細菌種類組成復雜，有對茯磚茶品質起促進作用的有益菌種，也有影響其品質形成的條件致病菌菌種，但其有益菌種和條件致病菌種也是相對的，茯磚茶加工中條件致病菌細菌會同有益微生物競爭營養物質，影響品質。因此，要制成品質好的茯磚茶，就必須根據細菌種類和作用的程度，以不同條件加以控制，有效抑制條件致病生長，并利用有益菌的生物轉化作用改善茯磚茶品質，更好地發揮黑毛茶原料的潛力，提高渥堆效率，充分彰顯茯磚茶保健品質特色。

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Preliminary Analysis of Bacterial Community Structure during Pile-Fermentation Process of Fuzhuan Brick Tea by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

LIU Shi-quan1,2, HU Zhi-yuan1ZHAO Yun-lin1,*
(1. College of Chemistry and Environment Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China; 2. College of Biology and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to explore the bacterial community structure and species during the pile-fermentation process of Fuzhuan Brick Tea, the V3 variable region of bacterial 16S rDNA was amplified at different fermentation times and analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and the DGGE bands were cloned, sequenced and aligned. The results showed that 24 hours of pile-fermentation was the critical point. A similar bacterial community structure was observed before and after the point, respectively, while a significant difference existed between the two stages. The sequence alignment of 16S rDNA V3 variable region showed that Millisia brevis, Novosphingobium sp., Brevundimonas aurantiaca, Pseudomonas veronii, Clostridium ultunense, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus plantarum, unculturable strains including Epsilon proteobacterium, Saprospiraceae bacterium, Myxococcales bacterium and Rhizobiales bacterium, and six species of unculturable bacteria with unknown taxonomic status were detected. Therefore, pile fermentation of the black tea involved a large number of bacteria, and the bacterial community during the process was relatively stable. In conclusion, DGGE fingerprint can provide a comprehensive and true reflection of changes in the bacterial community structure and diversity of Fuzhuan brick tea during the fermentation process.

Fuzhuan brick tea; pile-fermentation; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); bacterial community structure

S571.1，Q939.97

A

1002-6630（2014）15-0172-06

10.7506/spkx1002-6630-201415035

2013-07-29

湖南省自然科學基金項目（13JJ6074）；湖南省高校產學研合作示范基地產業化項目（13CY025；11CY003；11CY004）；

湖南省科學技術廳科技計劃國際合作項目（2012WK2013）；湖南省高校科技創新團隊支持計劃資助項目（2014）；

益陽市科學技術局科技計劃項目（2013YK1323）

劉石泉（1969—），男，副教授，博士研究生，研究方向為黑茶發酵。E-mail：lsq205@tom.com

*通信作者：趙運林（1959—），男，教授，博士，研究方向為生態學。E-mail：zyl8291290 @163.com