腸出血性大腸桿菌O157：H7變種Q蛋白對志賀毒素表達的影響

李嘉文，鄭冬冬，王宏勛，劉志國，余曉麗，周幗萍，李 睿,*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.河南醫藥技師學院制藥工程系，河南 開封 475000；3.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

腸出血性大腸桿菌O157：H7變種Q蛋白對志賀毒素表達的影響

李嘉文1,2，鄭冬冬1，王宏勛3，劉志國1，余曉麗1，周幗萍1，李 睿1,*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.河南醫藥技師學院制藥工程系，河南 開封 475000；3.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

1株腸出血性大腸桿菌O15 7：H7變種EC169菌株，攜帶stx基因但不表達志賀毒素。通過高效熱不對稱交錯聚合酶鏈式反應（high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction，hiTAIL-PCR）hiTAILPCR擴增得到EC169 stx1及其上游核苷酸片段并克隆測序，結果表明：EC169 q基因與標準株sakai q基因相比存在6個SNP位點。通過PCR擴增O157：H7高毒株EC150 q基因全長，并構建表達載體pkk223-q分別轉化EC169和低毒株EC157。反轉錄熒光定量PCR實驗結果表明，外源q基因在EC169和EC157重組菌中可高效表達，并引起EC157stx轉錄水平上調，但EC169重組菌stx轉錄水平不變。反向乳膠凝集實驗結果亦證實EC157重組菌志賀毒素表達量提高，而EC169重組菌志賀毒素表達量不變。Q蛋白變異可能并非EC169志賀毒素不表達的主要原因。

大腸桿菌O157：H7；Q蛋白；反轉錄熒光定量PCR；志賀毒素；hiTAIL-PCR

腸出血性大腸桿菌O157：H7是一類十分重要的食源性致病菌，感染人體后會出現腹痛、腹瀉、惡心或嘔吐，部分患者還會有發熱癥狀出現。可引起胃腸道以及全身性的疾病，如出血性腸炎和溶血性尿毒綜合征，臨床表現為溶血性貧血、急性腎衰竭、凝血功能障礙、血小板減少等[1-2]。感染嚴重者可導致病人死亡，一些重癥患者還會產生嚴重的神經系統并發癥[3-4]。1982年大腸桿菌O157：H7被認定為嚴重致病菌，其感染率也于20世紀90年代后逐年升高[5]。患者感染大腸桿菌O157：H7后，在使用抗生素治療時，有誘導志賀毒素表達和加劇病人病情的危險[6]。以上這些特點使腸出血性大腸桿菌O157：H7成為全球關注的焦點。

腸出血性大腸桿菌O157：H7的主要毒力因子是志賀毒素。志賀毒素（Shiga toxin，Stx）由噬菌體上的stx基因編碼[7-8]。stx基因位于Stx噬菌體的晚期操縱子中，有stx1和stx2兩種類型，分別編碼Stx1和Stx2兩種毒素[9-10]。q基因是晚期轉錄的抗終止基因，它編碼的Q蛋白作用于晚期啟動子PR’，激活stx基因轉錄，所以志賀毒素的表達與q基因密切相關[11]（圖1）。

圖1 1 stxstx基因的表達調控[12][12]Fig.1 Expression and regulation of stx gene[12]

Koitabashi等[13-14]從日本、泰國、中國山東省等地牛肉標本分離到了數株菌，這些菌屬于O157：H7或O157：H-血清型，都攜帶stx2基因，但不產志賀毒素2，經絲裂霉素C誘導，仍不能產生志賀毒素，研究發現這些菌q基因序列存在較大變異，可能由于Q蛋白活性弱導致Stx2表達量低。目前僅日本Miyamoto實驗室發表了類似的研究報告，但該類腸出血性大腸桿菌變種的志賀毒素基因表達調控機制尚不清楚[15]。本實驗室有1株日本Miyamoto實驗室贈送的腸出血性大腸桿菌O157：H7臨床株EC169，攜帶stx1和stx2基因但不產志賀毒素[16]。攜帶stx1但不產Stx1的O157菌株是否也由于獨特的q基因造成Q蛋白活性弱，造成Stx1不能正常表達，目前尚無報道。

本實驗擬研究腸出血性大腸桿菌O157：H7變種Q蛋白對志賀毒素表達的影響，為進一步研究大腸桿菌志賀毒素的表達調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸出血性大腸桿菌O157：H7臨床株：高毒株EC150與變種EC169由日本九州大學生命科學與技術學院Miyamoto實驗室贈送。腸出血性大腸桿菌O157：H7質控菌株：低毒株EC157由武漢市疾病預防與控制中心贈送。質粒pkk223由浙江工業大學朱廷恒老師贈送。

大腸桿菌DH5α 北京鼎國昌 盛生物技術有限公司；pGEM-T Easy載體 美國Promega公司；DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；DNA Marker、Ex Taq PCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉錄熒光定量PCR試劑盒、限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ等 日本TaKaRa公司；VTEC-RPLA檢測試劑盒 日本生研公司；GoldView核酸染料 北京博大泰克生物基因技術有限公司；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、引物合成 北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

5424R型臺式冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；CF15R型立式冷凍離心機 日本Hitachi公司；Spectrum752型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Tgradient型PCR儀 德國Biometra公司；ABI7500型熒光定量PCR儀 美國應用生物系統公司；Dyy-8C型電泳儀、DyCP-31D型電泳槽 北京市六一儀器廠；GBox-HR-E-M型凝膠成像儀 英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 EC169 q-stx1區hiTAIL-PCR擴增與克隆測序

高效熱不對稱交錯聚合酶鏈式反應（high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction，hiTAIL-PCR）實驗中長簡并引物（long arbitrary degenerate primer，LAD）采用LIU yaoguang等[17]設計的4條簡并引物LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4，并去掉了所添加的酶切位點。特異性引物（special primer，SP）為自己設計，SP1和SP2之間間隔306 bp，SP2和SP3之間間隔503 bp。LAD系列簡并引物分別與SP1用于第l輪PCR擴增，SP2和SP3分別與AC1用于第2和第3輪PCR擴增。序列見表1[17]。

表1 hiTAIL-PCR引物名稱及序列Table 1 Primers used for hiTAIL-PCR

EC169基因組DNA采用細菌基因組試劑盒提取。hiTAIL-PCR預擴增反應總體積為20 μL，PCR反應體系為：2 μL的10×Ex Taq buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTP、1.5 μL 10 μmol/L SP1、1 μL20 μmol/L的 LAD、2 μL模板DNA、0.2 μL Ex Taq DNA聚合酶，加無菌雙蒸水至總體積20 μL。取稀釋了100 倍的預擴增產物1 μL作為第1輪hiTAIL-PCR反應的模板。第1輪hiTAILPCR反應總體積為25 μL，反應體系如下：2.5 μL的10×Ex Taq buffer、2.64 μL 2.5 mmol/L dNTP、2 μL 10 μmol/L SP2、2 μL 10 μmol/L的ACl、1 μL模板DNA、0.2 μL Ex Taq DNA聚合酶，加無菌雙蒸水至總體積25 μL。取稀釋了20 倍的第1輪hiTAIL-PCR產物做為第2輪hiTAIL-PCR反應的模板。第2輪hiTAIL-PCR反應總體積為50 μL，反應體系如下：5 μL 10×Ex Taq buffer、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、2 μL 10 μmol/L SP3、2 μL 10 μmol/L的AC1、1 μL模板DNA、0.3 μL Ex Taq DNA聚合酶，加無菌雙蒸水至總體積50 μL。3輪hiTAIL-PCR反應條件見表2[17]。將PCR擴增得到的目的條帶切膠回收，并克隆到pGEM-T Easy測序載體，送往生工生物工程（上海）有限公司測序。

表2 hiTAIL-PCR循環條件Table 2 Thermal conditions for hiTAIL-PCR

1.3.2 構建表達載體pkk223-q及重組子的轉化

使用primer5設計能夠擴增高毒株EC150 q基因全長的引物，并在上游引物5’端加上EcoRⅠ的酶切位點，下游引物5’端加上HindⅢ的酶切位點。上游引物序列（5’→3’）：GAATTCATACAC TGGCGATAAA，下游引物序列（5’→3’）：AAGCTTATGCAGATTTTTAC GA，產物大小為509 bp。

PCR擴增反應體系為25 μL，其中dddH2O 18.3 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL， 10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL， Ex Taq酶0.2 μL，EC150 DNA 1.0 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94℃ 1 min，50 ℃ 30 s，72℃ 45 s，30 個循環；72 ℃ 10 min。滅菌三蒸水作為陰性對照。將PCR產物純化備用。

將pkk223載體用EcoRⅠ和HindⅢ酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離后進行切膠回收，將回收的目的條帶與EC150 q基因PCR產物連接，得到重組載體pkk223-q，轉化感受態細胞EC169和EC157，構建重組菌，菌落PCR驗證陽性克隆[18]。

1.3.3 絲裂霉素C誘導細菌

將EC157、EC169及重組菌接種到LB液體培養基，向培養基加入氨芐青霉素（ampicillin，Amp）至終質量濃度為80 μg/mL，37 ℃、150 r/min培養過夜。取菌液1 mL加入到4 mL新鮮的LB液體培養基中， 37 ℃、150 r/min培養2 h。加入絲裂霉素C至終質量濃度0.5 μg/mL，37 ℃、150 r/min培養4 h。

1.3.4 反轉錄熒光定量PCR分析基因轉錄

采用RNAiso Plus試劑盒提取EC157、EC169及重組菌的RNA。去除基因組DNA后，用PrimerScript RT試劑盒反轉錄得到cDNA。采用SyBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒進行熒光定量PCR。反應體系為：12.5 μL的SyBR Premix ExTaqTMⅡ(2 M)，上下游引物各1 μL，ROX Reference Dye（50×）0.5 μL，cDNA 1 μL，最后加RNase Free ddH2O至總體積為25 μL。以16S rRNA作為內參基因。q基因擴增上游引物為：CCGCAGTGCTGTGACGATGA，下游引物為：AATCCCCTCCGCTTTGTGAA。目的片段大小為189 bp。分別采用TaKaRa公司的EVS和EVT（RR105A）引物對擴增stx1和stx2基因。q、stx1、stx23 個基因的熒光定量PCR的反應體系和擴增條件相同。擴增反應具體條件為：95 ℃預變性10 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 個循環，在每一循環的退火階段收集熒光進行實時檢測。反應結束后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，記錄熒光信號的變化，得出擴增產物的熔解曲線。

1.3.5 反向乳膠凝集（reverse passive latex agglutination，RPLA）實驗

將EC169、EC157及重組菌接種于含80 μg/mL Amp的LB液體培養基中，37 ℃、150 r/min搖床過夜培養。取60 μL接種于3 mL新鮮CA-yE液體培養基中，36℃、130 r/min搖床培養2 h。向每管中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（終濃度為1 μmol/L）誘導毒素的表達，36 ℃、130 r/min搖床培養6 h。取3 mL菌液于離心管中900×g離心15 min，取上清即為RPLA檢樣。按VTEC-RPLA試劑盒說明書檢測大腸桿菌志賀毒素滴度。

1.3.6 噬菌體的誘導

將EC157、EC169菌株接種于5 mL LB液體培養基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養至OD600nm=0.8，將其轉入20 mL的LB液體培養基，并加入絲裂霉素C至終濃度為0.5 μg/mL，另設不加絲裂霉素C的組為對照。然后37 ℃、120 r/min繼續振蕩培養14 h，加入50 μL氯仿繼續震蕩培養15 min。紫外-可見分光光度計測其OD600nm值。

2 結果與分析

2.1 EC169 q-stx1區序列的hiTAIL-PCR擴增與克隆測序

以提取的EC169基因組DNA作為模板，將三輪擴增的產物進行電泳，通過在膠上觀察第一輪和第二輪PCR產物條帶相差的大小，是否與設計的SP2和SP3相差的大小一致來判斷是否為目的條帶。電泳檢測結果如圖2所示。用LAD1-3作為隨機引物擴增時在2 000 bp和1 000 bp都出現了特異 性條帶，并且兩條條帶的第3輪產物與第2輪產物的條帶大小差值與預期的503 bp都吻合，由此可初步判斷這兩條條帶均為目的條帶。為了獲得更長的stx1基因上游序列，將泳道 9中2 000 bp的條帶進行切膠回收并克隆測序，得到了EC169 stx1基因上游序列。

圖2 EC169 q--stx1區 hiTAIL-PCR擴增結果Fig.2 hiTAIL-PCR products of q-stx1region in EC169

將測序得 到的stx1基因及其上游q基因序列用DNAstar軟件進行序列拼接，并上傳至NCBI GenBank數據庫中，序列號為JQ327854.1。對EC169 stx1基因上游序列進行分析，晚期基因啟動子PR’、終止子tR’及stx1基因啟動子Pstx1均未發現突變。EC169的q基因與日本Sakai菌株相比有6 個SNP位點，相似性達98.6%。

2.2 反轉錄熒光定量PCR分析基因轉錄水平

由圖3可知，經過絲裂霉素C誘導后，EC157重組菌和EC157的3個基因轉錄水平都存在差異。EC157重組菌q基因轉錄水平明顯高于EC157，說明外源的q基因導入EC157重組菌后成功表達。EC157重組菌stx1和stx2基因轉錄水平均高于EC157，說明抗終止子Q蛋白在EC157重組菌中的高效表達，能促使stx基因的表達顯著上調。

圖3 EC157和EC157重組菌基因轉錄水平Fig.3 Relative mRNA transcription levels in EC157 and EC157 recombinant bacteria

圖4 EC169和EC169重組菌基因轉錄水平Fig.4 Relative mRNA transcription levels in EC169 and EC169 recombinant bacteria

由圖4可知，經過絲裂霉素C誘導后， EC169重組菌中q基因轉錄水平較高，而未導入外源q基因的EC169 q基因沒有mRNA的轉錄。EC169重組菌和EC169的stx1基因和stx2基因也沒有mRNA的轉錄。說明外源q基因導入EC169后能高效表達，但并未激活下游stx1基因和stx2基因的表達。

2.3 RPLA實驗結果

按VTEC-RPLA試劑盒說明書檢測大腸桿菌志賀毒素，在明亮處墊上黑紙觀察凝集現象。實驗結果顯示EC169、EC169重組菌志賀毒素1型和2型凝集價均小于1：2，說明志賀毒素產量很低無法檢出。EC157志賀毒素1型和2型凝集價分別為1：16和1：32，EC157重組菌志賀毒素滴度均有所上升，志賀毒素1型和2型凝集價達到了1：32和1：64。

2.4 噬菌體的誘導

未經絲裂霉素C誘導的EC157、EC169菌液渾濁，誘導后的EC157菌液較澄清但仍有少量菌體。而EC169菌液仍然較渾濁。分別用紫外-可見分光光度計測其OD600nm值，未經誘導的EC157O的D600nm值為1.770，EC169 O的D600nm值為1.745。經絲裂霉素C誘導后EC157的OD600nm值為0.180，EC169的OD600nm值為1.553。

3 結 論

腸出血性大腸桿菌O157：H7作為一種危害性極大的致病菌已引起人們的重視，研究也日益深入，但大部分集中在檢測和防控方面，志賀毒素調控機制的研究卻相對較少[19-20]。Koitabashi等[14]對一株攜帶stx2基因但不產Stx2毒素的O157菌株Thai-12研究發現，Thai-12 Stx噬菌體為缺陷型，不能正常復制，無法誘導出游離噬菌體。但將標準株EDL933的q基因導入菌株Thai-12后，stx2表達量大幅提高。推斷Q蛋白活性弱是導致Thai-12 stx2不能表達的主要原因之一[14]。

本實驗對一株攜帶stx1基因但不產志賀毒素的腸出血性大腸桿菌O157：H7 EC169進行研究，結果發現EC169 q基因與sakai標準株q基因相比存在6個SNP位點，但stx1基因的啟動子并未突變也沒有缺失。據文獻報道，絲裂霉素C可誘導大腸桿菌釋放噬菌體，提高志賀毒素表達量[21]。將高毒株EC150 q 基因導入低毒株EC157和無毒株EC169，誘導后通過反轉錄熒光定量PCR和RPLA實驗，檢測各個基因的轉錄和表達水平。經過絲裂霉素C誘導，EC157重組菌的q、stx1和stx2基因的轉錄水平明顯高于EC157，說明外源q基因在EC157重組菌中正常表達，并對下游stx基因轉錄的具有正調控作用。Mahesh等[22]也報道了高毒株中Stx噬菌體上的q基因與志賀毒素產量有相關性。

絲裂霉素C誘導后，EC169重組菌q基因轉錄水平顯著高于EC169，說明外源q 基因在EC169重組菌中順利表達，但仍然檢測不到stx1基因和stx2基因的轉錄。RPLA實驗進一步證實EC157重組菌中志賀毒素的表達量提高，而EC169重組菌中志賀毒素仍不能表達。噬菌體誘導實驗證實EC157中噬菌體可被誘導，而EC169 噬菌體可能為缺陷型噬菌體。Koitabashi等[14]報道的Thai-12 Stx噬菌體為缺陷型，但導入外源q基因能大幅提高Thai-12菌株stx2基因表達量，本實驗的菌株EC169則觀察不到此類現象，推測Q蛋白變異可能不是EC169不表達志賀毒素的主要原因。

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Effect of Protein Q on Shiga Toxin Expression in Enterohemorrhage Escherichia coli O157 Variant

LI Jia-wen1,2, ZHENG Dong-dong1, WANG Hong-xun3, LIU Zhi-guo1, YU Xiao-li1, ZHOU Guo-ping1, LI Rui1,*
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. Department of Pharmaceutical Engineering, Henan Medicine Technician College, Kaifeng 475000, China; 3. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

An enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157: H7 strain EC169 carrying both stx1and stx2genes but not producing Shiga toxins was used in this study to investigate the reason for these characteristics. The stx1gene and its upstream region from EC169 were amplified by hiTAIL-PCR. Sequencing data showed that EC169 q gene had 6 single nucleotide polymorphism (SNP) sites compared with the corresponding region of the typical strain sakai. A highly virulent O157:H7 strain EC150 and a hypovirulent O157: H7 strain EC157 were tested in this study. The full length of EC150 q gene was amplified and connected to the expression vector pkk223. The recombinant plasmid was then transformed into EC169 and EC157, respectively. The qRT-PCR results showed that the pkk223-q vector was efficiently expressed in the two recombinant strains, respectively. qRT-PCR and RPLA results demonstrated that the level of Shiga-toxin expression was improved in EC157 recombinant strain, but its expression was not changed in EC169 recombinant strain. These results suggest that the SNP variation of protein Q might not be responsible for the non-expression of Shiga-toxins in EC169, suggesting that other mechanisms may be involved in controlling the expression of Shiga-toxins in EC169. This study might contribute to study the control and regulation of Stx phage.

E. coli O157: H7; protein Q; qRT-PCR; Shiga-toxin; hiTAIL-PCR

R378.2

A

1002-6630（2014）15-0151-05

10.7506/spkx1002-6630-201415031

2013-10-21

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2012AA101703-3）；教育部留學回國人員科研啟動基金項目（教外司留20111139）；湖北省教育廳優秀中青年人才計劃項目（Q20111710）；武漢市科技局國際科技合作計劃項目（2013030409020113）

李嘉文（1988—），男，碩士研究生，主要從事食品安全和食品微生物研究。E-mail：821483258@qq.com

*通信作者：李睿（1972—），女，教授，博士，主要從事食品安全和食品微生物研究。E-mail：liruiwuhan@163.com