富硒小麥提取物中硒含量及其抗氧化特性

趙 萍，劉笑笑，王 雅，張 軼，郭 濤

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

富硒小麥提取物中硒含量及其抗氧化特性

趙 萍，劉笑笑，王 雅，張 軼，郭 濤

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

為研究富硒小麥的富硒水平和硒的賦存形態，選用蘭州高硒地區生產的富硒小麥為原料，通過超聲、離心、透析的方法將富硒小麥中的有機硒和無機硒分離，用火焰原子吸收光譜法測定小麥硒水平。結果表明，富硒小麥硒的主要賦存形態是有機態，占總硒的84.36%。有機態硒主要為硒蛋白（54.46%），硒多糖次之，少量為硒核酸和其他有機態硒。在蛋白態硒中，清蛋白和谷蛋白硒含量較高，分別占總硒的19.46%和16.83%。抗氧化性分析結果表明，多糖相對于蛋白和核酸提取物，具有更長的誘導時間、更高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和Fe3+還原力。皮爾遜相關性分析表明，小麥富硒提取物抗氧化能力與其硒含量之間表現為顯著的正相關性。

富硒小麥；賦存形態；硒含量；火焰原子吸收光譜法；抗氧化能力

自由基理論認為，在生物體內，氧化還原反應所產生的羥自由基，可以引發不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，損傷膜結構及功能并引起各類疾病[1]，超氧陰離子與羥基結合后的產物能損傷生命大分子而導致各種疾病。自由基是引起機體衰老的根本原因，因此消除體內多余自由基以延長壽命已成為共識[2]。

硒是生物體必需的微量元素[3]，也是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成成分，它可以保護機體不受由自由基引起的氧化性損傷的損害[4]，對機體的生長發育、免疫機能和抗氧化性發揮重要作用[5-6]。硒缺乏會導致心臟病、肌肉萎縮和人體機能的紊亂，這些情況也同樣存在于一些動物物種當中[7]。通過膳食攝入硒（1 mg/d）是必需的[8]，但高濃度的硒會使人中毒。研究認為有機硒比無機硒的毒性低且吸收率高，有機硒在體內存在的形式主要有硒蛋白、硒多糖和硒核酸等[9]。

生長在高硒土壤上的植物硒含量顯著高于缺硒或低硒土壤上生長的同種植物。蘭州皋蘭地區屬于天然高硒地區，小麥是中國人最主要的食物之一。探討富硒小麥硒的賦存形態、富硒水平、抗氧化能力及之間的關系，能夠為充分開發和利用高硒地區的富硒小麥這一寶貴資源提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隴春3030富硒小麥 產地：甘肅河西地區 甘肅省農業科學院提供；硒標準溶液 甘肅省質監局；Ni(NO3)2溶液：用體積分數為1%的HNO3配制，質量濃度為10 mg/mL；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；VC 天津市醫藥工業技術研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Z-5000火焰原子吸收光譜儀（帶火焰發生裝置、硒空心陰極燈） 日本島津公司；CAPY 50紫外-可見分光光度計 美國瓦里安公司；743油脂氧化儀 瑞士萬通公司；DG120粉碎機 瑞安市春海化學設備制造廠；TD-5-A離心機 上海安亭科學儀表制造廠；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE52-86A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 硒的測定方法

采用火焰原子吸收光譜法[10]，儀器工作主要參數為：硒空心陰極燈；波長196 nm，燈電流14.5 mA，狹縫寬度1.3 nm，火焰高度12.5 mm，空氣流量5.0 L/min，乙炔流量1.5 L/min。

1.3.1 硒標準曲線的制備

分別取0、1、3、4、6 mL 質量濃度為100 ng/mL的硒標準儲備液于25 mL比色管中，加入1 mL Ni(NO3)2溶液（質量濃度為10 mg/mL），定容至刻度。配制成質量濃度為0、4、12、16、24 ng/mL的硒標準液并測定吸光度。

1.3.2 富硒小麥樣品含硒量的測定

精確稱取待測樣品1.000 0 g于定氮瓶中，加數粒玻璃珠，緩慢加入10 mL混合酸（HNO3與HClO4體積比為4∶1），冷消化過夜后于電爐上消化至產生大量白煙，將消化液轉移至50 mL容量瓶中，洗滌定氮瓶，合并洗液，加2 mL Ni(NO3)2溶液[11]，定容至刻度，測定硒含量。

1.3.3 無機硒含量的測定[12]

準確稱取1.000 0g樣品，置于圓底燒瓶內，加入用4 mol/L HCl 30 mL，然后于170 ℃條件下加熱，回流20 min，冷卻后用定量濾紙過濾雜質，定容，得濾液，測得濾液中的硒含量即為樣品中無機硒含量。

1.4 富硒小麥富硒組分的提取

1.4.1 富硒小麥中蛋白組分的提取

1.4.1.1 富硒小麥中蛋白組分的提取工藝

1.4.1.2 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[13]。

1.4.2 富硒小麥中多糖組分的提取

1.4.2.1 富硒小麥中多糖組分的提取工藝

1.4.2.2 多糖的測定方法

采用苯酚-硫酸法[14-15]并在此方法基礎上加以改良。

1.4.3 富硒小麥中核酸組分的提取

1.4.3.1 富硒小麥中硒核酸的提取工藝

富硒小麥粉碎脫脂過篩→95 ℃水浴，NaCl提取→抽濾→濃縮上清液→脫蛋白→HCl調pH值至2.5→4 ℃靜置12 h→離心→95%乙醇淋澆沉淀→真空冷凍干燥→核酸粉末

1.4.3.2 硒核酸含量的測定

采用紫外吸收法測定核酸含量[16-17]。

1.5 提取液脫蛋白方法的選擇

分別采用Sevag法[18]和三氯乙酸法[18]對樣品提取液進行脫蛋白，并比較兩種方法蛋白清除率和硒的損失率。

式中：T為粗提液中硒含量與總硒含量之比；T1為脫蛋白液硒含量與總硒含量之比。

式中：R為粗提液中蛋白百分含量；R1為脫蛋白液中蛋白百分含量。

1.6 抗氧化性的研究

將富硒小麥不同提取物進行抗氧化實驗，并與VC進行比較。

1.6.1 對DPPH自由基清除能力的測定

通過測定被測化合物清除DPPH自由基的能力來分析樣品的抗氧化性。對參考文獻[19]作少量修改，精確吸取不同質量濃度的樣品溶液2.000 mL，與2.000 mL質量濃度0.025 mg/mL的DPPH溶液和2.000 mL無水乙醇混合，搖勻后放置30 min。以無水乙醇為對照，用分光光度計分別測定上述溶液在517 nm波長處的吸光度。用對應質量濃度的VC作比較實驗。

式中：Ai為樣液與DPPH溶液混合的吸光度；Aj為樣液的吸光度；A0為DPPH溶液的吸光度。

1.6.2 總還原力的測定

被測化合物的總還原力參考文獻[20]并作少量修改。分別取不同質量濃度的樣液2.5 mL于試管中，以蒸餾水為空白對照，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和2.5 mL 1 g/100 mL六氰合鐵酸鉀溶液，50 ℃水浴中保溫20 min，快速冷卻后加入2.5 mL 10%醋酸溶液。3 000 r/min條件下離心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1 g/100 mL 三氯化鐵溶液，充分混勻，混合物靜止10 min后，在700 nm波長處測其吸光度。以吸光度表示還原能力。用對應質量濃度的VC作對照實驗。

1.6.3 抗油脂氧化能力的測定

通過誘導時間來表示抗油脂氧化穩定性。使用油脂氧化儀測定誘導時間[21]：110 ℃，空氣流速20 L/h。在每個反應管中添加3.00 g豬油、提取物樣液和3 滴吐溫。誘導時間與抗氧化能力呈正相關，即誘導時間越長，抗氧化能力越強。以VC作對照實驗。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

通過回歸分析得到標準曲線回歸方程：蛋白質標準曲線y=0.007 1x+0.005 4（R2=0.999 6）；葡萄糖標準曲線y=20.586 0x-0.005 8（R2=0.998 2）；硒標準曲線y=0.000 1x+0.004 7（R2=0.993 7）。

2.2 多糖提取液脫蛋白不同方法的比較

表1 兩種方法脫蛋白效果的比較Table 1 Comparison of the efficiency of two methods for protein removal

由表1可知，Sevag法具有較高的脫蛋白率和較低的硒損失率，通過方差分析得出2 種方法的脫蛋白率具有顯著性差異（P＜0.001），硒損失率也具有顯著性差異（P＜0.005），因此本實驗采用Sevag法對粗多糖進行脫蛋白。

2.3 富硒小麥中硒的賦存研究

2.3.1 硒在小麥籽粒中的賦存水平

用火焰原子法測定小麥各組分硒含量可知，富硒小麥粉的總硒含量為（41.14±0.02）ng/g，其中硒主要以有機態存在，其含量為（34.65±0.03）ng/g，占總硒量的8 4.3 6%，無機硒提取物硒含量為（6.49±0.04）ng/g。由表2可知，富硒小麥中硒的主要賦存形態為：蛋白態硒、多糖態硒、核酸態硒。蛋白態硒主要結合于小麥的4 種蛋白質中，分別占有機硒比例為：麥清蛋白23.04%、麥球蛋白12.68%、麥醇蛋白為11.20%、麥谷蛋白19.93%。多糖態硒的3 種提取物硒含量分別占有機硒比例為：堿溶性多糖2.83%、水溶性多糖9.03%、酸溶性多糖4.42%。富硒小麥中硒主要賦存形態按含硒量大小依次排序為：麥清蛋白、麥谷蛋白、麥球蛋白、水溶性多糖、麥醇蛋白、酸溶性多糖、核酸提取物、堿溶性多糖。

表2 富硒小麥不同賦存形態硒含量（以絕干計）Table 2 Comparison of Se levels and speciation in Se-enrich wheat (on a dry matter basis)

2.3.2 硒在小麥籽粒各組分中的分布比例

圖1 硒在小麥籽粒中的分布比例Fig.1 Distribution of selenium species in Se-enriched wheat

由圖1可知，富硒小麥硒含量主要為有機形式存在，占總硒量的84.36%；其中蛋白結合態硒占總硒含量高達54.46%，說明小麥籽粒中有機態硒主要是以硒蛋白的形式存在，多糖結合態硒占總硒15.75%，其他少量硒賦存于硒核酸和其他有機形式硒中。

2.4 抗氧化性的測定結果

2.4.1 DPPH自由基清除能力的比較

圖2 不同小麥提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activities of organic Se compounds extracted from Se-enriched wheat

圖3 不同溶解性硒蛋白提取物對DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activities of different Se-binding proteins extracted from Se-enriched wheat

由圖2、3可知，富硒小麥含硒提取物對DPPH自由基均有一定的清除能力。以半數抑制量IC50值來評價樣品清除自由基能力，IC50值越高表明樣品清除自由基的能力越差，抗氧化性也就越差，DPPH自由基清除能力大小為：VC＞多糖提取物＞蛋白提取物＞核酸提取物。不同溶解性硒蛋白的抗氧化性強弱順序為：麥清蛋白（IC50=0.914 mg/mL）＞麥谷蛋白（IC50=0.974 mg/mL）＞麥球蛋白（IC50=1.061 mg/mL）＞麥醇蛋白（IC50=1.214 mg/mL）。

2.4.2 總還原力的比較

圖4 不同小麥提取物的總還原力Fig.4 Total reducing power of organic Se compounds extracted from Se-enriched wheat

圖5 不同溶解性蛋白提取物的總還原力Fig.5 Total reducing power of different Se-binding proteins extracted from Se-enriched wheat

由于吸光度大小與抗氧化性強弱成正相關，由圖4、5可知，抗氧化性強弱關系為：VC＞多糖提取物＞蛋白質提取物＞核酸提取物。樣品質量濃度增加，吸光度也隨之增加，吸光度越高表明抗氧化性越強。當樣品質量濃度達到0.5 mg/mL時，VC和蛋白提取物抗氧化性強弱的順序為：麥清蛋白＞麥谷蛋白＞麥球蛋白＞麥醇蛋白。

2.4.3 抗油脂氧化穩定性

圖6 不同小麥提取物對誘導時間的影響Fig.6 Influence of different samples on induction time

由圖6可知，不同的硒提取物的誘導時間有一定的差異，通過單因素方差分析得出抗氧化能力由強到弱排列：VC＞多糖提取物＞麥清蛋白＞麥谷蛋白＞麥球蛋白＞麥醇蛋白＞核酸提取物＞空白，與清除DPPH自由基能力和總還原力的測定結果一致。

2.5 抗氧化活性與硒含量的關系

表3 富硒小麥含硒提取物抗氧化活性與其硒含量的相關性分析Table 3 Correlation analysis of antioxidant activity with selenium content in different extracts of Se-enriched wheat

為了進一步了解小麥富硒提取物抗氧化活性和其硒含量之間的相關性，本實驗分析了兩者之間的皮爾遜（Pearson）相關系數，結果如表3所示，小麥中富硒提取物抗氧化性與其硒含量之間的相關性表現為顯著的正相關性。表明富硒提取物中的硒對其抗氧化作用具有顯著增強作用。

3 結 論

富硒小麥籽粒中硒主要以有機態存在，占總硒的84.36%。有機態硒中以蛋白硒（54.46%）為主要賦存形式，硒多糖次之，少量為硒核酸和其他有機態硒。在蛋白質結合硒中，清蛋白和谷蛋白中硒含量較高，分別占總硒的19.46%和16.83%；抗氧化性分析結果表明，硒多糖相對于蛋白和核酸提取物，具有更強的抗氧化能力，主要是由于它具有更長的誘導時間、更高的DPPH自由基清除能力和總還原力，這可能與多糖本身含有一些未知的具有抗氧化活性的成分有關。富硒蛋白提取物抗氧化活性依次為：麥清蛋白＞麥谷蛋白＞麥球蛋白＞麥醇蛋白。核酸提取物抗氧化能力不顯著。富硒小麥蛋白、多糖以及核酸提取物中硒的化學結構目前來說仍不明確，硒對小麥油脂等其他有機部位的作用尚未研究，需要進一步的研究來確定在富硒小麥含硒提取物中硒的結構。

[1] 方允中, 李文杰. 自由基與酶基礎理論及其在生物學和醫藥中的應用[M]. 北京: 科學出版社, 1994: 122-142.

[2] SCARTEZZINI P, SPERONI E. Review on some plants of Indian traditional medicine with antioxidant activity[J]. Ethnopharmacol, 2000, 71(12): 23-43.

[3] ROTRUCK J T, POPE A L, GANTHER H E, et al. Selenium biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J]. Science, 1973, 179: 588-590.

[4] GUPTA U C, GUPTA S C. Selenium in soil and crops, its deficiencies in livestock and human: implications for management[J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2000, 31: 1791-1807.

[5] RAYMAN M P. The importance of selenium to human health[J]. Lancet, 2000, 356: 233-241.

[6] 李萍, 朱濱, 劉開泰. 微量元素硒與人體健康[J]. 微量元素與健康研究, 1996, 13(4): 45-46.

[7] ZIN Z M, HAMID A A, OSMANA. Antioxidative activities of chromatographic fractions obtained from root, fruit and leaf of Mengkudu (Morinda citrifolia L.)[J]. Food Chemistry, 2006, 94: 169-178.

[8] FOSTER L H, SUMAR S. Methods of analysis used for the determination of selenium in milk and infant formulae: a review[J]. Food Chemistry, 1995, 53: 453-466.

[9] 吳永堯. 水稻對環境硒的富集和耐受能力研究[J]. 微量元素與健康研究, 1999, 16(4): 42-44.

[10] 蒲國強, 范衍瓊, 馮婉麗. 火焰原子吸收光譜法同時測定飲用水中4種元素[J]. 現代預防醫學, 2008, 35(5): 926-927.

[11] 梁保安, 張富捐. 火焰原子吸收光譜法測定蘭州百合中的8種微量元素[J]. 光譜學與光譜分析, 2007, 27(4): 813-815.

[12] 梅光泉, 應惠芳. 微量元素硒與植物有機硒化合物[J]. 微量元素與健康研究, 2003, 20(6): 59-61.

[13] 李娟, 張耀庭, 曾偉, 等. 應用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[J]. 中國生物制品學雜志, 2000, 13(2): 118-120.

[14] DUBOIS M GILLES K A, Hamilton J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

[15] 崔喬, 尚德靜. 硒多糖的研究進展[J]. 中國生化藥物雜志, 2003, 24(3): 155-157.

[16] 張淑桂, 錢敏. 稀堿法提取酵母RNA的正交試驗研究[J]. 云南化工, 1994(2): 10-12.

[17] 景桂蘭, 劉祖昌, 李冬偉. 核酸含量的測定[J]. 廣東微量元素科學, 1999(11): 48-49.

[18] FUKUDA K, UEMATSUT, HAMADA A, et al. The polysaccharide from Lampteromyces japonicus[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), 1975, 23(9): 5-9.

[19] vanAMSTERDAM F T M, ROVEI A, MAIRINO M, et al. A dihydropyridine calcium antagonist with antioxidant activity[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1992, 12: 183-187.

[20] 趙萍, 王雅, 張軼, 等. 葵花籽粕乙醇提取物的抗氧化活性的研究[J].食品科學, 2007, 28(10): 219-222.

[21] VELASCO J, DOBARGANES C, HOLGADO F, et al. A follow-up oxidation study in dried microencapsulated oils under the accelerated conditions of the Rancimat test[J]. Food Research International, 2009, 42: 56-62.

Selenium Content and Antioxidant Activity of Selenium-Enriched Wheat

ZHAO Ping, LIU Xiao-xiao, WANG Ya, ZHANG Yi, GUO Tao
(School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

In order to investigate selenium (Se) levels and speciation in Se-enriched wheat, organic and inorganic selenium (Se) from wheat samples grown in Lanzhou were separated by ultrasonic pretreatment, centrifugation and dialysis and determined by flame atomic absorption spectrometry. The results showed that Se existed mainly in organic form, accounting for 84.36% of the total Se in Se-enriched wheat. The organic Se was mainly bound to protein (54.46%), followed by polysaccharide, and a small amount of Se was bound to nucleic acid or other organic components. Albumin and glutelin comprised 19.46% and 16.83% of total Se-containing proteins, respectively. The results of antioxidant activity showed that the polysaccharides had longer induction time and higher 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and reducing activity than protein extracts and nucleic acid extracts. Pearson correlation analysis indicated that the antioxidant capacity of Se-enriched wheat extracts had a significant positive correlation with Se contents.

selenium-enriched wheat; speciation; selenium content; flame atomic absorption spectrometry; antioxidant capacity

TS210.7

A

1002-6630（2014）15-0094-05

10.7506/spkx1002-6630-201415019

2013-04-16

甘肅省自然科學研究基金計劃項目（0803RJZA044）

趙萍（1964—），女，教授，碩士，主要從事食品科學、副產物綜合利用研究。E-mail：pinhzhaogdqg@163.com