氟維司群細菌內毒素檢查方法學研究

劉 琦，陸益紅

（江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇南京210008）

氟維司群細菌內毒素檢查方法學研究

劉 琦，陸益紅

（江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇南京210008）

目的建立氟維司群原料藥的細菌內毒素檢查方法。方法以DMSO溶解氟維司群，再用細菌內毒素檢查用水稀釋，按《中國藥典》2010年版（二部）附錄ⅪE細菌內毒素檢查法進行干擾試驗；同時對DMSO溶解氟維司群的步驟進行細菌內毒素回收率試驗。結果氟維司群的最大不干擾濃度為0.25 mg·mL－1，DMSO溶解液細菌內毒素回收率在100%～150%之間。結論氟維司群原料藥可采用細菌內毒素檢查法控制其質量。

氟維司群；細菌內毒素；干擾試驗；回收率試驗

氟維司群是一種新型雌激素受體拮抗劑，以乳腺癌細胞的雌激素受體為靶點，下調其作用。治療對象為已接受抗雌激素藥物（如他莫昔芬），但病情仍趨惡化的絕經后婦女，制劑劑型為注射液。相關臨床研究顯示療效與阿那曲唑相當，且耐受性良好，關節疾病不良反應發生率明顯降低［1～3］。為更好的控制產品質量，保證用藥安全，有必要對氟維司群原料進行細菌內毒素檢測。氟維司群在水中不溶，需要進行適當處理。本次研究使用DMSO進行溶解，再將溶解液進行細菌內毒素凝膠法檢查，通過干擾試驗和DMSO溶解液的細菌內毒素回收率試驗，表明氟維司群可以采用凝膠法檢測細菌內毒素。

1 試劑與藥品

1.1 藥品 氟維司群（連云港潤眾制藥有限公司生產，批號：07913001、07913002、07913003）。

1.2 試劑 細菌內毒素工作標準品（WSE），規格：100 EU／支，批號：150601－201176，中國藥品生物制品檢定所提供；細菌內毒素檢查用水（BET），規格：5 mL／支，批號：W2012－08，中國藥品生物制品檢定所提供；鱟試劑1（TAL1），規格：0.1 mL／支，批號：1310170，靈敏度：0.25 EU·mL－1，湛江安度斯生物有限公司提供；鱟試劑2（TAL2），規格：0.1 mL／支，批號：1402110，靈敏度：0.25 EU·mL－1L，湛江博康海洋生物有限公司提供。

2 試驗方法及結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核［4］按《中國藥典》2010年版（二部）附錄的要求進行試驗，經復核，兩種鱟試劑靈敏度的測定值均在0.5～2.0λ之間，符合規定要求，結果見表1。

表1 TAL靈敏度復核結果

2.2 細菌內毒素限值（L）的確定 根據細菌內毒素限值的計算公式：L＝K／M，其中K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量。本品為原料藥，參考氟維司群注射液臨床用法用量：肌肉注射，一次250 mg。故K為5.0 EU·（kg·h）－1，M為4.17 mg·mL－1，則L＝1.2 EU·mg－1，經適當調整，最終確定氟維司群的細菌內毒素限值為1 EU·mg－1。

2.3 供試品有效稀釋濃度的計算 目前市售鱟試劑靈敏度一般在0.5～0.03 EU·mL－1之間，按照MVD＝cL／λ的計算公式，氟維司群的對應有效稀釋濃度為C0.5＝0.5 mg·mL－1；C0.25＝0.25 mg·mL－1；C0.125＝0.125 mg·mL－1；C0.06＝0.062 5 mg·mL1；C0.03＝0.031 25 mg·mL－1。

2.4 干擾預實驗 將氟維司群用DMSO溶解成10 mg·mL－1的溶液，再用BET進行稀釋使成0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL－1的系列溶液，記為NPC。同時在上述試驗液中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的試驗液中均含有2λ濃度的細菌內毒素，將此系列溶液記為PPC。取靈敏度為0.25 EU·mL－1的兩個不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進行反應，每一濃度平行做2支，同時做陽性和陰性對照。結果表明氟維司群在0.25 mg·mL－1時對鱟試劑凝集反應可能無干擾作用，結果見表2。

表2 氟維司群干擾試驗預試驗

2.5 干擾試驗 將氟維司群用DMSO溶解成10mg· mL－1的溶液，再用BET稀釋成0.25 mg·mL－1的溶液。按《中國藥典》2010年版（二部）附錄ⅪE中的細菌內毒素檢查供試品干擾試驗項進行實驗，試驗結果表明Es均在0.5～2.0λ之間，且Et也均在0.5～2.0 Es之間，說明氟維司群濃度為0.25 mg·mL－1時對鱟試劑凝集反應無干擾作用，結果見表3。

2.6 回收率試驗 為驗證DMSO溶解氟維司群的過程是否對供試品中細菌內毒素含量產生影響，本次研究設計了細菌內毒素回收試驗。

表3 氟維司群干擾試驗

取氟維司群樣品，加入細菌內毒素標準品溶液（100 EU·mL－1）適量混合成每1 mg氟維司群含細菌內毒素1 EU，加DMSO使溶解成含細菌內毒素10 EU·mL－1的溶液，作為供試品溶液，再用BET水稀釋成20、40、80、160倍稀釋液，按照《中國藥典》2010年版（二部）附錄ⅪE中凝膠半定量試驗。結果顯示，內毒素回收率在100%～150%之間，說明DMSO作為溶劑對樣品中細菌內毒素的含量沒有影響，見表4。

表4 氟維司群的DMSO溶解液細菌內毒素回收率試驗

2.7 樣品的細菌內毒素檢查 根據以上的干擾試驗和細菌內毒素回收率試驗，擬定氟維司群的細菌內毒素質量標準為：取本品，用DMSO溶解成氟維司群含量為10 mg·mL－1的溶液，再用細菌內毒素檢查用水稀釋，依法檢查［《中國藥典》2010年版（二部）附錄ⅪE］，每1 mg氟維司群中內毒素含量應小于0.25 EU。依此標準檢驗，3批樣品結果均符合規定，結果見表5。

3 討論

細菌內毒素檢查凝膠法要求將供試品內的內毒素溶于水中使鱟試劑和內毒素的凝集反應能夠進行，因此對于難溶性藥物（包括固體和非水溶液），尋找合適的前處理方法是首要要素，文獻報道的方法主要有加入助溶劑或有機溶劑進行溶解或用水萃取［5～7］。但需要注意此時不僅應考察干擾試驗，還需要對有機溶劑的溶解步驟進行細菌內毒素回收率考察［8］。本次研究曾嘗試使用乙腈作為溶劑，干擾試驗表明供試品溶液無干擾作用，但依照前文進行細菌內毒素回收率試驗時發現回收率低于50%，不能滿足藥典要求。

表5 氟維司群樣品細菌內毒素檢測結果

根據本次研究，氟維司群采用凝膠法進行細菌內毒素檢查是可行的，本品限值為1EU·mL－1，按照擬定的質量標準檢查，三批樣品均符合規定。

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［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（二部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅪE 99－101.

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［6］楊先啟.紫杉醇細菌內毒素檢測方法的探討［J］.安徽醫藥，2005，9（5）：356－357.

［7］胡容融.注射用油細菌內毒素檢查方法的研究［J］.廣東藥學院學報，2002，18（2）：99－101.

［8］胡宇馳，李娜，周建平.十一酸睪酮注射液細菌內毒素檢查方法學研究［J］.藥物分析雜志，2010，30（12）：2425－2429.

Study on the determ ination method of the bacterial endotoxins in fulvestrant

LIU Qi，LU Yi-hong
（Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China）

ObjectiveTo establish the bacterial endotoxins determination method for fulvestrant.M ethodsDMSO were added to dissolve fulvestrant，then dilute the solution with pyrogen－free water.The interference testwas conducted according to the appendixⅪE of Chinese Pharmacopoeia 2010 Vol.Ⅱ，the endotoxins recovery test of DMSO solution was conduct.ResultsMaximum nondisturb concentration of fulvestrant for bacterial endotoxins test was 0.25 mg·mL－1，the endotoxins recovery of DMSO solution was100%～150%.ConclusionThe established method of endotoxins testwas feasible for fulvestrant.

Fulvestrant；Bacterial endotoxins；Interference test；Endotoxins recovery test

R927.12

A

2095－5375（2014）12－0696－003

劉琦，男，主管藥師，研究方向：藥物分析，E－mail：yyandlq＠hotmail.com