半邊旗有效成分5F對(duì)腹膜炎小鼠血清NO和細(xì)胞因子的影響

葉 華，龔先玲，李 立，吳科鋒，呂應(yīng)年，符偉玉，鄭學(xué)寶

（廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023）

·實(shí)驗(yàn)研究·

半邊旗有效成分5F對(duì)腹膜炎小鼠血清NO和細(xì)胞因子的影響

葉 華，龔先玲，李 立，吳科鋒，呂應(yīng)年，符偉玉，鄭學(xué)寶

（廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023）

目的研究半邊旗有效成分貝殼杉烷型二萜類化合物5F對(duì)腹膜炎小鼠血清一氧化氮（NO）和細(xì)胞因子IL－6、IL－10、TNF－α、MCP－1的影響。方法預(yù)先給予50和100 mg·kg－15F溶液3 d后，腹腔注射50 mg·kg－1酵母多糖建立腹膜炎模型，Griess法測(cè)一氧化氮含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL－6、IL－10、TNF－α和MCP－1的水平。結(jié)果與模型組比較，5F可以降低腹膜炎小鼠血清一氧化氮水平（P＜0.05），減少IL－6、IL－10、TNF－α和MCP－1含量（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論5F可以有效減少酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠血清一氧化氮、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量。

半邊旗；腹膜炎；一氧化氮；細(xì)胞因子

半邊旗（Pteris semipinnata L.，PsL）是一種傳統(tǒng)中藥，廣泛分布于我國(guó)南部，常被用于治療各種炎癥性疾病，如肝炎、病毒性腸炎和毒蛇咬傷等［1］。我們從半邊旗中分離提取獲得貝殼杉烷型二萜類化合物5F（ent－11α－h(huán)ydroxy－15－oxo－kaur－16－en－19－olic acid），化學(xué)結(jié)構(gòu)名為11－α－羥基－15－氧－16－烯－對(duì)映貝殼杉烷－19－酸［2］。前期研究發(fā)現(xiàn)，5F具有一定的抗炎作用，可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活化。NO和細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立酵母多糖誘導(dǎo)的急性腹膜炎小鼠模型，觀察5F對(duì)小鼠血清NO、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1的影響，評(píng)價(jià)5F的抗炎作用并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 5F干粉由本實(shí)驗(yàn)室（廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）提供，經(jīng)丙二醇溶解，蒸餾水稀釋，制成丙二醇體積分?jǐn)?shù)為0.15，5F質(zhì)量濃度為1 000 mg·L－1的儲(chǔ)備液，除菌過(guò)濾后冷藏保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)再以培養(yǎng)基稀釋至所需濃度（丙二醇最終濃度≤0.012）。雌性ICR小鼠，4～6周齡，體重18～22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2011－0003。酵母多糖購(gòu)自Sigma公司，Cytometric Bead Array（CBA）Mouse Inflammation Kit購(gòu)自BD－PharMingen公司，NO試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 腹膜炎小鼠模型的制備及分組給藥 雌性ICR小鼠32只，隨機(jī)均分為4組，空白組、模型組、5F低劑量組和高劑量組。5F低、高劑量組分別灌胃給予50和100 mg·kg－15F溶液，模型組灌胃給予等體積PBS，連續(xù)給藥3 d。最后一次給藥6 h后，除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射50 mg·kg－1酵母多糖。6 h后斷頭采血，收集血清，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Griess法測(cè)NO含量 按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于550 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)所測(cè)亞硝酸鹽濃度推算NO含量。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔滲出液中IL－6、IL－10、TNF－α和MCP－1的含量 取50μL血清，與50μL包被特異抗體的捕獲微球、50μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體混合物預(yù)混合，反應(yīng)2 h。按照CBA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本和標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本含量。

2 結(jié)果

2.1 5 F抑制腹膜炎小鼠NO的釋放 Griess法測(cè)腹膜炎小鼠血清NO含量，結(jié)果顯示，5F組血清NO有所下降，其中100 mg·kg－1劑量組與模型組相比，差異具有顯著性（見(jiàn)圖1，P＜0.05）。

圖1 5F對(duì)腹膜炎小鼠血清NO含量的影響

2.2 5 F對(duì)腹膜炎小鼠分泌細(xì)胞因子的影響 取各組動(dòng)物血清，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1水平，結(jié)果顯示，與模型組相比，5F 50和100 mg·kg－1劑量組TNF－α、IL－6和MCP－1含量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），5F 100 mg·kg－1劑量組IL－10含量明顯減少（P＜0.01）（見(jiàn)表1）。

表1 5F對(duì)腹膜炎小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量的影響

3 討論

酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎是一個(gè)比較經(jīng)典的動(dòng)物急性炎癥模型，發(fā)作快、攻擊30 min后即可檢出炎癥反應(yīng)，是一種炎癥反應(yīng)程度較輕的非致死性炎癥［3～5］。本實(shí)驗(yàn)觀察5F對(duì)酵母多糖誘導(dǎo)的腹膜炎小鼠血清NO和細(xì)胞因子的影響，結(jié)果顯示，5F可以調(diào)節(jié)小鼠血清中異常的NO、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量，與模型組相比，5F 50和100 mg·kg－1劑量組NO、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量均有不同程度降低。

NO是炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)因子，也是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，參與多種炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，并與多種炎癥因子相互作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，腹膜炎患者和動(dòng)物模型的透出液和血清中NO升高，增高的NO進(jìn)而調(diào)節(jié)腹膜血流，提高腹膜滲透性，影響腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能［7，8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠血清NO含量較正常對(duì)照組明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，而5F可以明顯降低小鼠升高的血清NO含量，提示5F對(duì)腹膜炎小鼠的保護(hù)作用可能與降低 NO水平有關(guān)。

腹膜炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中單核巨噬細(xì)胞作為第一道防線，產(chǎn)生TNF－α和IL－1，進(jìn)而刺激生成IL－6，激活并集聚白細(xì)胞［9，10］。這些前炎性細(xì)胞因子的釋放實(shí)際是一種抵御炎癥的宿主反應(yīng)，然而釋放過(guò)量會(huì)導(dǎo)致組織損傷。因此，機(jī)體還釋放IL－4、IL－10等抗炎細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)前炎性細(xì)胞因子的作用，平衡前者的損傷效應(yīng)［11］。TNF－α和IL－6等促炎因子可顯著增強(qiáng)MCP－1表達(dá)，并與相應(yīng)受體結(jié)合啟動(dòng)炎性細(xì)胞的活化與遷移，并通過(guò)濃度梯度引導(dǎo)炎性細(xì)胞遷移到病灶發(fā)揮作用清除病原體［12］。在腹膜炎患者和動(dòng)物模型都存在高水平的TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1，這些細(xì)胞因子繼而刺激機(jī)體產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)，如活性氧、NO、自由基、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等，并活化內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生微循環(huán)損傷和組織損害［13～15］；藥物治療可以降低這些細(xì)胞因子的水平，減輕病情［16～18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5F可以有效降低腹膜炎小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1水平而減輕臟器損傷，研究結(jié)果為進(jìn)一步探討5F的抗炎作用機(jī)制及新藥開(kāi)發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of 5F，an extract from Pteris sem ipinnata L.serum NO and cytokine levels in zymosan A－induced peritonitism ice

YE Hua，GONG Xian-ling，LILi，WU Ke-feng，LV Ying-nian，F(xiàn)UWei-yu，ZHENG Xue-bao
（Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China）

ObjectiveTo investigate the effect of 5F，an extract from Pteris semipinnata L.serum NO and cytokine levels in zymosan A－induced peritonitismice.M ethodsAfter pretreatmentwith 50 and 100 mg·kg－15F solution for 3 d，mice were intraperitoneal injection of 50 mg·kg－1zymosan to induce peritonitis.The release of nitric oxide wasmeasured by a Griess reagentsystem.The serum levels of IL－6，IL－10，TNF－αand MCP－1 were determined by flow cytometry.ResultsCompared withmodel group，5F pretreatment could decrease the overproduction of NO，IL－6，IL－10，TNF－αand MCP－1（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion5F could significantly reduce the serum level of NO，TNF－α，IL－6，IL－10 and MCP－1 in zymosan A－induced peritonitismice.

Pteris semipinnata L.；Peritonitis；NO；Cytokine

R285.5

A

2095－5375（2014）12－0683－003

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.30772701）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009C3104003）；湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.2012C3104019，2013A01008）；廣東醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（No.Z2013001）、面上項(xiàng)目（No.M2013003）和博士啟動(dòng)項(xiàng)目（No.B2013019）

葉華，女，講師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，E－mail：yehua2008＠foxmail.com