Placket-t Burman設計和響應面法優化殘次香蕉發酵生產單細胞蛋白飼料工藝的研究

馬麗衛，楊勁松，張利娟，譚海生

（海南大學食品學院，海南?？?570228）

Placket-t Burman設計和響應面法優化殘次香蕉發酵生產單細胞蛋白飼料工藝的研究

馬麗衛，楊勁松*，張利娟，譚海生

（海南大學食品學院，海南海口 570228）

利用殘次香蕉生產單細胞蛋白飼料，采用Placket-t Burman實驗設計方法篩選出接種量、培養時間和培養溫度為主要影響因素，再利用Box-Behnken響應面法對主要影響因素進行分析，并預測出發酵的最優化工藝條件。實驗得到最優工藝條件為：接種量12%，培養時間50h，培養溫度27℃，此時粗蛋白含量為30.65%，與預測值30.38%相差極小，證明該模型合理。

殘次香蕉，單細胞蛋白，Placket-t Burman實驗設計，響應面法

單細胞蛋白又稱生物菌體蛋白或微生物蛋白，是指酵母菌、霉菌、非致病性細菌等單細胞微生物體內所產生的菌體蛋白質，含量為40%~80%[1]。單細胞蛋白飼料的研究成果很令人矚目，且取得了巨大的經濟效益。目前，各國科學家在對原料性質、菌種選育、發酵工藝學、營養學和毒理學等方面進行了廣泛而系統地研究，重點集中在原料的適當預處理；利用分子重組原理構建新的菌種，滿足自然選種的不足；以及發酵工藝理論模型的建立，以便于從理論推導出微生物發酵的最優條件，此方面的研究定會對資源緊張污染起到緩解作用[4]。

在香蕉產地存在著相當數量的殘次香蕉，主要包括越冬期或受病蟲害發育不良的果穗，以及在香蕉收獲旺季，過熟香蕉也很多，這些香蕉既不宜生食，也不宜加工其他產品[5]。殘次香蕉中含有豐富的淀粉、碳水化合物、粗蛋白和少量還原糖，糖化后仍具有很高的含糖量，因此適宜用來生產單細胞蛋白，變廢為寶。利用殘次香蕉生產單細胞蛋白飼料可以緩解飼料短缺的現狀，同時對減少環境污染也有重要意義。本研究糖化殘次香蕉的基礎上，利用釀酒酵母作為菌種，對已糖化的殘次香蕉發酵生產單細胞蛋白飼料的工藝進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殘次香蕉 采集于海南省中國熱帶農業科學院基 地 ；As2.346、As2.399 釀 酒 酵 母（Saccharomycescerevisia） 海南大學食品學院實驗室；酵母菌活化培養基 麥芽汁液體培養基；殘次香蕉固體發酵培養基 糖化后的殘次香蕉加入麩皮攪拌均勻后即為固體發酵培養基。

馬氏凱式定氮儀 深圳市三利化學品有限公司；PHS-3C酸度計 上海精密科學儀器有限公司；MP5002電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HWS-430恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠；DHG-9203A電熱鼓風干燥箱 鶴壁市科奧儀器表制造有限公司；WBL25B26果汁機 廣東美的廚衛電器制造有限公司；IKA控溫搖床 廣州儀科實驗室技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蕉的催熟 自然催熟，使香蕉皮的棱角由銳角變為鈍角。

1.2.2 酵母菌菌懸液的制備[6]將斜面菌種接入麥芽汁液體培養基中，29℃搖瓶培養48h，鏡檢細胞數為108個/mL。

1.2.3 糖化方法[7]殘次香蕉按1∶3的料水比放置到果汁機中打漿，打漿后置于150mL的三角瓶中，調pH4.5后，加入α-淀粉酶1%，70℃水浴液化40~50min，在62℃的水浴條件下添加黑曲霉糖化6h。

1.2.4 發 酵 方 法 取 糖 化 后 的 殘 次 香 蕉 醪 裝 至250mL三角瓶中，添加適量的麩皮，攪拌均勻后在121℃、條件下滅菌20min，取出使其冷卻，在超凈臺中接入As2.346、As2.399釀酒酵母（1∶1）發酵菌種，恒溫條件下發酵一定時間，75℃烘干至恒重后進行粗蛋白的測定。

1.2.5 蛋白測定方法 采用GB 50095-2010中凱氏定氮法。

1.2.6 實驗設計

1.2.6.1 Placket-t Burman實驗設計[8-10]本實驗選取N=12的Placket-t Burman設計，研究影響殘次香蕉生產單細胞蛋白飼料的8個因素：發酵溫度（A），發酵時間（B），接種量（C），麩皮添加量（D），尿素（E），硫酸銨（F），磷酸二氫鉀（G），硫酸鎂（H）。每個因素取兩個 水 平，“-1”為低水 平 ，“1”為 高 水平，以 粗 蛋 白含量作為響應值，設計結果見表1。

表1 Plackett-Burman實驗各因素水平Table 1 Factors and levels of independent variable in Plackett-Burman design

1.2.6.2 響應面實驗設計 采用Box-Behnken響應面設計，以接種量、發酵時間、發酵溫度作為自變量（X1，X2，X3），粗 蛋 白 含 量 作 為 響 應 值（Y），進 行 三 因素三水平響應面實驗分析，實驗設計因素水平見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計因素水平表Table 2 Factors and levels of independent variable in Box-Behnken design

1.2.7 數據分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據分析。

表3 N=12的Placket-t Burman發酵實驗設計結果Table 3 Experimental result of N=12 Placket-t Burman design

2 結果與分析

2.1 Placket-t Burman設計結果與分析

按照1.2.6.1進行Plackett-Burman設計，設計[11]及實驗結果見表3，分析結果見表4。由表4的主效應分析結果可知，在設計的2水平范圍內，影響發酵較為重要的三個因素為：接種量、發酵時間和發酵溫度。所以選擇這3個主要影響因素做進一步響應面分析[12-13]。

表4 Placket-t Burman實驗設計的因素水平及效應分析Table 4 Placket-t Burman design factor level and effect analysis

2.2 響應面法實驗設計及結果分析

按照1.2.6.2進行Box-Behnken響應面實驗設計，實驗方案見表5。按照表5進行實驗得到響應的粗蛋白含量。運用Design-Expert 8.0.6軟件對表5實驗結果進行分析，得到二次多項回歸方程為：Y=30.11+ 0.32X1+0.30X2-1.38X3+0.005X1X2+0.075X1X3-0.45X2X3-0.45X12-1.79X22-2.36X32，回歸方程的方差分析結果見表6。

由表6可知，失擬項不顯著（p=0.0565＞0.05），而模型的p＜0.0001，表明模型高度顯著；軟件分析后得到模型的R2=99.13%，校正后的R2Adj=98.02%，表明該模型擬合度良好，可以用此模型對殘次香蕉發酵生產單細胞蛋白飼料進行分析和預測。模型中一次項X1、X2顯著，X3極顯著；二次項X22、X32極顯著，X12顯著；交互項X2X3顯著，X1X2、X1X3不顯著。從F值可以看出，單因素對蛋白質含量的影響順序依次是X3＞X2＞X1，即發酵溫度＞發酵時間＞接種量[14]。

表5 響應面Box-Behnken實驗方案與結果Table 5 Design and response value of Box-Behnken experiment

表6 二次多項模型及其各項的方差分析表Table 6 Analysis of variance for the quadratic model

圖1~圖3為響應面軟件分析的各因素之間的交互作用圖，從圖中可以更加直觀地了解各響應因子對響應值的影響，每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳水平。圖1為發酵溫度保持在30℃時，接種量與發酵時間對粗蛋白含量的影響。從圖1中可以看出，隨著發酵時間的增加，粗蛋白含量出現一個較大的曲面弧度，其影響要大于接種量，即X2＞X1。圖2為發酵時間保持在48h時，接種量與發酵溫度對粗蛋白含量的影響。從圖2可以看出接種量對粗蛋白含量的影響呈現一個較平滑的曲面，而發酵溫度過高，不適宜酵母菌生長，從而對粗蛋白含量的影響有一個較陡的曲面。可以得出發酵溫度對粗蛋白含量的影響要大于接種量對其的影響，即X3＞X1。圖3所示為接種量保持在10%時，發酵溫度和發酵時間交互作用對粗蛋白含量的影響。從圖3可以看出發酵溫度和發酵時間對粗蛋白含量都有較大影響，選擇適宜的溫度和適當的發酵時間可以得到較高的粗蛋白含量。根據兩因子的曲面幅度大小[15]可以得出發酵溫度對粗蛋白含量的影響要大于發酵時間對其的影響，即X3＞X2。

圖1 接種量和發酵時間交互影響真蛋白含量的響應面圖Fig.1 Response surface of inoculation amount and fermentation temperature on the content of protein

圖2 接種量和發酵溫度交互影響真蛋白含量的響應面圖Fig.2 Response surface of inoculation amount and fermentation time on the content of protein

圖3 發酵溫度和發酵時間交互影響真蛋白含量的響應面圖Fig.3 Response surface of fermentation temperature and fermentation time on the content of protein

根據Design-Expert 8.0.6軟件中的Optimization分析得出優化結果，最終確定殘次香蕉發酵生產單細胞蛋白飼料的最優生產工藝條件為：接種量11.69%，培養時間50.87h，培養溫度27.02℃，蛋白質含量為Y= 30.38%。

2.3 驗證實驗

為確定建立的模型與實驗結果是否相符，根據實際情況對優化的工藝條件進行校正：接種量12%，培養時間50h，培養溫度27℃，得到實際單細胞蛋白飼料的粗蛋白含量為30.65%。預測值與實驗值之間良好擬合性證實了模型的有效性。結果證明，該模型準確，適用于優化殘次香蕉發酵生產單細胞蛋白飼料的生產工藝條件，具有很好的指導意義。

3 結論

以殘次香蕉為原料，在單因素實驗結果基礎上，利用Placket-t Burman設計和Box-Behnken響應面法優化殘次香蕉發酵生產單細胞蛋白飼料的工藝條件，得到適宜的生產工藝條件為接種量12%，培養時間50h，培養溫度27℃，蛋白質含量預估值為30.38%，驗證實驗值為30.65%，與預估值誤差很小，證明此模型合理，可用于實際生產。本研究將殘次香蕉進行合理的利用，減少了其被任意處理所造成的環境污染，同時擴增了蛋白質飼料的資源，具有實際應用價值。

[1]J P Wang，J D Kim，J E Kim，et al.Amino acid digestibility of single cell protein from Corynebacterium ammoniagenes in growing pigs[J].Animal Feed Science and Technology ，2013（180）：111-114.

[2] 董衍明，馬雁玲.單細胞蛋白飼料的開發與利用[J].飼料研究，2005（9）：25-27.

[3] 張繼，武光朋，王文強，等. 單細胞蛋白飼料研究進展[J]. 飼料工業，2006，27（19）：50-52.

[4] 吳晉強，王力生，劉琦山，等.酒糟-單細胞蛋白（SCP）及其對畜禽飼養效應的研究Ⅳ酒糟-SCP取代日糧中常規蛋白質飼料對母牛泌乳性能的影響[J]. 安徽農業大學學報，1999，26（2）：170-173.

[5] 吳金模，楊銘真. 利用殘次香蕉制作香蕉糖漿的研究[J]. 食品工業科技，1997，（6）：41-42.

[6]楊希娟，孫小鳳，肖明，等.馬鈴薯渣固態發酵制作單細胞蛋白飼料的工藝研究[J]. 飼料工業，2009，30（3）：19-22.

[7]L W Ma，J S Yang，L J Zhang，et al.Optimization of Inferior Banana Saccharifiction with Response Surface Methodology[J]. Advanced Materials Research，2014：864-867.

[8] 沈秀軍，劉 柳 ，高 亮，等. 基于Plackett-Burman設計的 刺 糖多孢菌培養條件優化[J]. 皖西學院學報，2012，27（5）：87-91.

[9] 鄭惠娜，章超樺，吉宏武，等.Plackett-Burman設計在胰酶酶解馬氏珠母貝肉蛋白主要影響因子篩選中的應用[J]. 食品科技，2010，35（12）：28-32.

[10] 高楓，葛穎新，劉濤，等. 稻殼制備活性炭Plackett-Burman工藝優化研究[J]. 無機鹽工業，2013，45（1）：24-26.

[11]余文華，李潔芝，張其圣，等.柑橘廢渣生產單細胞蛋白飼料研究[J].食品與發酵工業，2008，39（9）：101-104.

[12] 張田田，沈明.Placket-tBurman設計和響應面法優化火紅密孔菌發酵產漆酶培養基[J].食品工業科技，2011，32（9）：223-226.

[13]曲麗娜，王瑞明，肖靜，等.β-甘露聚糖酶高產菌株發酵條件優化[J]. 食品與發酵工業，2012，38（12）：64-69.

[14]J S Yang，T T Xu，H S Tan，et al.Research on optimal aspergillus saccharifying cassava residues technology by response surface[J].Advanced Materials Research Vols，2012（347-353）：1758-1763.

[15]樸美子，于翠芳，寧杰，等.響應面法優化黑木耳糙米醋的發酵工藝[J]. 食品工業科技，2010，31（7）：197-202.

Study on optimization of production conditions for single cell protein feed from inferior bananas by Placket-t Burman design and response surface methodology

MA Li-wei，YANG Jin-song*，ZHANG Li-juan，TAN Hai-sheng
（College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，China）

One experiment was conducted to produce single cell protein feed by using inferior bananas.Drawing assistance from Design-Expert 8.0.6 software ，Placket-t Burman experimental design and response surface methodology were applied to optimizing production conditions for single cell protein feed from inferior bananas. The important factors influencing protein production ，which were identified by initial experimental design of Placket-t Burman were inoculation，fermentation temperature and fermentation time.Box-Behnken design and response surface analysis were adopted to further investigate the mutual interaction between the variables and obtain optimal values that bring maximum protein production.The optimal conditions for the maximal production discriminated from the regression equation were ：inoculation 12% ，fermentation temperature 27℃ ，fermentation time 50h.The protein content was 30.65% ，which had a small error with the predictive value of 30.38% ，the model was proved to be reasonable.

inferior bananas；single cell protein；Placket-t Burman design；response surface methodology

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0209-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.037

2014－02－17

馬麗衛（1987-），女，碩士研究生，研究方向：應用微生物技術。

* 通訊作者：楊勁松（1966-），女，博士，研究方向：應用微生物技術。

國家自然科學基金資助項目（31460621）；海南大學科研啟動基金資助項目（kyqd1315）；國家星火計劃項目（2008GA800015）；?？谑兄攸c科技項目（2008GA800015）。