稻米中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的研究進展

賴先文，張 荷，劉承蘭

（天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，華南農業大學，廣東廣州 510642）

稻米中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的研究進展

賴先文，張 荷，劉承蘭*

（天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，華南農業大學，廣東廣州 510642）

真菌毒素是由某些絲狀真菌產生的有毒代謝產物，在自然界中普遍存在，嚴重威脅人畜健康。綜述了黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的理化性質及危害，在稻米中的污染現狀、限量標準及分析方法等方面進行闡述，希望能給真菌毒素的研究提供一些參考。

真菌毒素，黃曲霉毒素，赭曲霉毒素A，稻米

真菌毒素（Mycotoxin）是由產毒真菌在適宜的環境條件下產生的有毒代謝產物，廣泛分布于糧食、食品、飼料等中，具有急、慢性毒性和致畸、致癌、致突變等作用，嚴重威脅人畜健康[1-2]。據聯合國糧農組織（FAO）估算，全球每年約有25%的農產品受到真菌毒素的污染，2%的農產品因污染嚴重而失去營養價值和經濟價值，造成數百億美元的經濟損失[3]。在已報道的眾多真菌毒素如黃曲霉毒素（Afltoxins，AFT）、赭曲霉毒素（Ochratoxin A，OTA）、伏馬菌素（Fumonisins，FBs）、玉 米 赤 霉 烯 酮（Zearalenone，ZON）和 脫 氧 雪腐 鐮 刀 菌 烯 醇（Deoxynivalenol，DON）和 桔 青 霉 素（Citrinin，CIT）等中[4]，黃曲霉毒素和赭曲霉毒素由于毒性強且在農作物中污染普遍[2，5-6]，從而受到了各國政府和科研工作者的高度重視。

1 真菌毒素的理化性質及危害

1.1 黃曲霉毒素

黃 曲 霉 毒 素（AFT）是 一 類 主 要 由 黃 曲 霉（Asperillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）等產生的有毒代謝產物。目前已報道的黃曲霉毒素有AFB1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇等20多種化學結構相似的化合物，其中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2是糧食中黃曲霉毒素的主要存在形式[7-8]。黃曲霉毒素的基本結構由一個二呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（即香豆素）組成，前者為其毒性結構，后者可能與其致 癌 作 用 有 關[9]；其 相 對 分 子 量 為 312~346，難 溶 于水，易溶于甲醇、乙腈、丙酮和氯仿等有機溶劑，在紫外光照射下，黃曲霉毒素B1、B2發藍色熒光，黃曲霉毒素G1、G2發綠色熒光。黃曲霉毒素在中性及酸性溶液中較為穩定，當pH為9~10發生可逆分解；耐高溫，普通的加熱處理很難破壞其結構。黃曲霉毒素是一類毒性極強的劇毒物質，可使人及動物肝臟組織造成損傷，嚴重時可導致肝癌甚至死亡；同時還能造成胃腸功能障礙、生殖能力下降和出血性貧血等不良影響[10]。其中，以黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌性最強，1993年被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構（IARC）劃定為I類致癌物[11]。

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素是一類主要由赭曲霉（A.ochraceus）、疣 孢 青 霉（Penicillium verrucosum）和 炭 黑 曲 霉（A.carbonarius）等產生的有毒代謝物，包括A、B、C等7種結構類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大、分布最廣[12]。赭曲霉毒素A是由異香豆素與β-苯丙氨酸結合的衍生物，相對分子質量403.8，熔點169℃，純品為無色針狀晶體，微溶于水，易溶于極性溶劑和碳酸氫鈉溶液，在紫外光下呈綠色熒光，在苯-乙酸（99/1，v/v）溶液中最大吸收波長為333nm。OTA對熱相對穩定，一般的烹飪加工方法只能使其部分分解。OTA毒性作用的主要靶器官為腎臟，可引起多種急慢性腎臟疾病，并被認為與巴爾干地方性腎病有關；還具有肝毒性、神經毒素、免疫毒性等，可導致胎兒畸形、流產甚至死亡，具有致畸、致癌作用[13-15]。1993年，世界衛生組織（WHO）下的癌癥研究機構（IARC）將其劃為2B類致癌物（可能致癌物）[11]。

2 黃曲霉毒素和赭曲霉毒素在稻米中的污染現狀和限量標準

目前，黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A等真菌毒素污染已成為影響糧食質量安全的主要因素之一，研究報道世界范圍內的水稻、玉米、小麥、高粱等糧谷類作物都不同程度地受到了真菌毒素的污染[8，16-19]。全世界約一半以上人口以稻米作為主食，僅在亞洲，就有20億人從稻米及稻米產品中攝取60%~70%的熱量[20]，因此，稻米中真菌毒素的污染對世界各國的人畜健康都是一個嚴重的威脅。目前已報道在韓國、越南、印度、伊朗、巴基斯坦、尼日利亞、土耳其、瑞典、西班牙、墨西哥、摩洛哥、突尼斯和加拿大等國家的稻米中發現有黃曲霉毒素和赭曲霉素A等真菌毒素的污染[21-33]（見表1）。由此可見，稻米真菌毒素的污染已成為世界范圍內一個非常嚴峻的問題。

2012/2013年，我國稻谷總產量2億t左右，按平均出米率73%計算，折合稻米產量約為1.46億t，約占全國三大糧食作物總產量的40%和世界稻谷總產量的30%[34]。而且，稻米是我國人民的主食，食用人口占總人口的60%以上。據有關部門統計，我國糧食總產量的70%~80%都儲藏在農村，由于儲糧設施簡陋、儲藏條件差、儲糧技術落后、缺乏科學管理手段等原因，極易受到真菌及真菌毒素的污染。2006年，Liu等[35]對遼寧省儲藏1~14年的16個全谷和37個糙米樣品進行了黃曲霉毒素的檢測，檢出陽性樣品分別為16個和36個，平均含量分別為3.87μg/kg和0.88μg/kg；2008年，楊家玲[36]對我國10個城市的91個大米制品中赭曲霉毒素A進行了調查，平均含量為1.938μg/kg；2011年，滕南雁等[37]對來自廣西地區的34批大米中的黃曲霉毒素進行了檢測，其中3批大米檢出了黃曲霉毒素B1，含量均為1μg/kg。

隨著人們對食品安全問題的日益重視，真菌毒素也受到了前所未有的廣泛關注，先后有100多個國家、地區和組織制訂了各種真菌毒素的限量標準（見表2），以保護農牧業的健康發展和人類身體健康。

表1 部分國家大米中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的污染情況Table 1 Contamination situation of aflatoxins and ochratoxin A in rice in some countries

表2 部分國家稻米中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的最高允許限量Table 2 The maximum levels of the aflatoxins and ochratoxin A in rice in some countries

3 黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的分析方法

大多數真菌毒素的化學性質都很穩定，即便是烹飪加工等過程也不容易破壞其活性，而生產實踐中又很難避免真菌毒素的產生。另外，隨著世界貿易自由化、經濟全球化的不斷加深，真菌毒素限量已成為限制農產品出口的技術性貿易壁壘之一。因此，建立簡便、快速、靈敏的分析方法對掌握稻米中真菌毒素的污染程度和有效降低其危害具有十分重要的意義。

3.1 黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的前處理方法

充分提取是分析檢測的前提，對于稻米等固體基質中真菌毒素的提取，提取溶劑一般采用甲醇、乙腈和水的混合溶液；提取方式主要有振蕩、超聲和高速均質等。除了酶聯免疫吸附法對凈化的要求不高外，大多數用于檢測真菌毒素的方法必須進行恰當的凈化處理[38]。前處理非常耗時，但是，這些步驟至關重要，直接影響分析結果的準確性和可靠性。

3.1.1 液液萃取 液液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE）是基于相似相溶原理，使分析物在兩種互不相溶的溶劑中達到平衡，經過反復多次萃取達到分離純化。其優點是操作簡單、方法穩定、成本低，回收率也可達到要求。常規的液液萃取具有有機溶劑使用量大、對環境不友好和費工費時等缺點，已經不能適應“綠色、快速”萃取技術的要求。目前，相繼出現了液相微萃取、液膜萃取和逆流色譜等綠色分離技術[39]。分散液液微萃取是2006年Rezaee等[40]首次提出的用于萃取水樣中有機物的微型液-液萃取方法，具有操作簡便，富集倍數高，萃取效果好等優點，也被廣泛應用于各類樣品中真菌毒素的提取，如葡萄酒中的OTA[41]、蘋果 汁 中 的 展青 霉 素[42]、啤 酒 中 的 玉 米 赤 霉烯酮[43]和谷物中的黃曲霉毒素[44]等。

3.1.2 固相萃取 固相萃取（Solid phase extraction，SPE）是在液固萃取和柱液相色譜技術基礎上逐漸發展起來的一種用途廣泛的樣品前處理技術。與LLE相比，SPE具有回收率和富集倍數高、有機溶劑用量少、無相分離操作、能處理微量樣品和易于實現自動化等優點，是目前最常用的樣品預處理方法之一。隨著色譜分離技術的發展，樣品預處理領域也得到了顯著發展，先后出現了全自動固相萃取儀、全自動凝膠凈化系統、固相微萃取以及基質分散固相萃取等新技術和新方法[45]。李堯等[46]以C18為填料，建立了基質分散固相萃取凈化-液相色譜檢測谷物中赭曲霉毒素A的分析方法，結果表明，在優化的色譜條件下，可以完全分離谷物中的赭曲霉毒素A，方法回收率為80.0%～93.65%，最低檢測限為0.5μg/kg，表明該方法能夠快速、準確地檢測谷物中赭曲霉毒素A的含量。

3.1.3 免 疫 親 和 柱 凈 化 免 疫 親 和 柱 凈 化 法（Immunoaffinity column，IAC）結合了單克隆抗體技術和親和層析技術，利用抗原-抗體免疫反應的原理，使用單克隆抗體選擇性的吸附提取液中的真菌毒素，以達到分離凈化的目的。該方法具有靈敏度高、特異性強、溶劑消耗少和凈化效果好等特點，是很多官方機構檢測真菌毒素的標準凈化方法[47-49]。

3.1.4 多功能柱凈化 多功能凈化柱（Multifunctional purifying column，MFC）是 一 類 特 殊 的 SPE 柱 ，以 極性、非極性及離子交換等幾類基團組成填充劑，選擇性吸附提取液中的脂類、蛋白類、糖類等各類雜質，而待測的真菌毒素不被吸附直接通過。與傳統的SPE相比，無需經過耗時的活化、淋洗和洗脫過程，可直接上樣，一次性完成凈化。此方法操作簡單、凈化效果較好、適用于多殘留分析。缺點是價格不便宜，對赭曲霉毒素A的回收率偏低[50-51]。

3.2 黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的檢測方法

3.2.1 薄 層 色 譜 法 薄 層 色 譜 法（ Thin layer chromatography，TLC）是一種傳統的真菌毒素分析方法，具有經濟簡單、靈敏高效等優點，被廣泛用于高濃度真菌毒素的定量和半定量分析。國外已經有許多關于薄層色譜法分析真菌毒素的報道，但結果表明TLC法靈敏度較低，操作復雜，分析結果的可重復性和再現性差[52-53]。因此，近年來國際上采用TLC方法檢測新真菌毒素的報道已較少，表明TLC在檢測真菌毒素領域的發展受到了一定的限制。不過，隨著高效薄層色譜法（HPTLC）及薄層掃描儀的發展和應用，提高了TLC的分離效率和檢測精確度，進而拓寬了TLC技術在真菌毒素痕量分析領域中的應用。Gao等[54]采用HPTLC測定了谷物中的黃曲霉毒素B1，檢出限和定量限分別為0.22ng和0.66ng，以空白樣品為基底進行添加回收實驗（添加濃度分別為5、10和15ng/g），平均回收率達到81.0%~90.0%。

3.2.2 高 效 液 相 色 譜 法 高 效 液 相 色 譜 法（High performance liquid chromatography，HPLC）是 分 析 真菌毒素最常用的定量方法，在新的國際標準體系中已經處于絕對的主導地位，作為定量的檢測方法，在國內外實驗室和檢測機構得到普遍的使用[55]。對于黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A的檢測，主要采用熒光檢測器檢測，結合流動相、色譜柱、柱溫和流速等因素，優化色譜條件，從而有效分離各種真菌毒素。由于黃曲霉毒素的熒光特性受溶劑影響大，在極性流動相中，不飽和的AFB1和AFG1極易發生熒光猝滅現象，所以必須在柱前或柱后進行衍生化來增強熒光。目前常用的衍生化方法有柱前三氟乙酸衍生化法、柱后碘衍生化法、柱后溴衍生化法和柱后光化學衍生法[56-57]。

3.2.3 高效液相色譜與質譜聯用 高效液相色譜與質譜聯用方法（High performance liquid chromatography/ mass spectrometry，LC/MS）適用于大多數真菌毒素的分析，可以同時提供分析物的保留時間和分子結構信息，具有雜質影響小，靈敏度高，適合多組分分析等優點，且可以同時進行定量分析與定性確證，是目前認可的通用檢測方法。Soleimany等[58]利用LC-MS/ MS方法同時測定谷物中的AFT、OTA和FBs等11種真菌毒素，樣品用有機溶劑提取后，經簡單的離心處理后進行檢測，檢出限在0.01~20μg/kg內，回收率在76.8%~108.4%之間。

3.2.4 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法（Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）是1971年由荷蘭學者Van Weeman和Schurrs，瑞典學者Engvall和Perlman同時提出的將免疫技術用于檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法[59]。目前，ELISA法已成為檢測真菌毒素的重要方法，它具有靈敏、操作簡便、樣品前處理無需凈化（或只需簡單凈化）、樣品處理量大等優點，已建立多種分析各類農產品和食品中真菌毒素的ELISA方法。同時，已有商品化的檢測糧油食品中多種真菌毒素（如AFT、OTA、伏馬菌素、T-2毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮等）的ELISA試劑盒。不過，ELISA相比于其他方法，檢測結果的重現性和酶穩定性差，試劑壽命短，且存在交叉反應造成的假陽性問題，因此還需要結合其他方法進行驗證。目前，ELISA常用于多種毒素的定性篩選檢測[60]。

3.2.5 時間分辨熒光免疫技術 時間分辨熒光免疫技 術（Time-resolved fluoreimmuoassay，TRFIA）是 20世紀80年代發展起來的一種非放射標記分析技術[61]。TRFIA是用具有特殊熒光的鑭系離子與螯合劑結合作為示蹤物標記蛋白質、多肽、激素、抗體等，在一定的反應體系（抗體抗原免疫反應、核酸探針雜交反應等）發生反應后，用時間分辨熒光儀測定產物中的特異熒光強度，推測反應體系中分析物的濃度，從而達到對待測物進行定量分析的目的[62-63]。TRFIA技術具有靈敏度高、特異性強、穩定性好，且測定范圍寬，試劑 壽 命 長 ，操 作 簡 便 和 非 放 射 性 等 特 點[64]。 同 時 ，TRFIA具有排除其他熒光干擾，從而克服ELISA的不足，且一次可測定多個樣品的優勢，現已用于多種真菌毒素的檢測[65-66]。李靜等[65]建立了時間分辨熒光免疫技術測定油料餅粕中的黃曲霉素B1，回收率在70% ~120%之間。黃飚等[66]采用雙標記時間分辨熒光免疫分析技術建立同時檢測AFB1和OTA的方法，AFB1的靈敏度達到了0.02μg/L，測量范圍為0.02~100μg/L，平均回收率為88.1%；OTA的靈敏度達到了0.05μg/L，測量范圍為0.05~50μg/L，平均回收率為89.9%。

3.2.6 多種真菌毒素的聯合檢測 當前，單個真菌毒素的檢測技術已非常成熟，相關的研究報道也較多，但鑒于真菌毒素毒性強，且存在疊加、增效等互作效應[67]，嚴重威脅人畜健康，各國分析工作者紛紛開始研究多種真菌毒素的聯合檢測。與單獨檢測相比，真菌毒素的聯合檢測方法顯示出巨大的優勢，不僅縮短了分析時間、提高了食品安全性，同時節約了大量的試劑和能源成本。目前關于AFT和OTA同時檢測的方法主要有HPLC和LC-MS/MS方法[68-69]；也有研究采用ELISA同時檢測AFT和OTA[70]。但是，由于不同種類的真菌毒素在理化性質上存在差異，要同時使每種真菌毒素都達到最佳分析條件將非常困難，這也導致聯合檢測的靈敏度和平均回收率一般都低于單獨檢測。本課題組采用分散液液微萃取結合液相色譜分析，研究同時檢測大米中的黃曲霉毒素B1、B2和赭曲霉毒素A，取得了較滿意的結果[71]。

4 展望

真菌毒素是影響稻米質量安全的主要因素之一，嚴重危害人類和動物的健康。隨著科學技術的發展，真菌毒素的作用機理越來越得到闡明；同時，一些新的真菌毒素也將被發現，并可能顯示出更大的危害。因此，真菌毒素的研究必將是21世紀的熱門課題之一。我國是水稻的最大生產國，稻米也是我國居民最基本、最重要的主糧，稻米質量安全直接關系到全國人民的健康，涉及到整個國家的糧食安全和社會穩定。鑒于世界范圍內稻米真菌毒素的污染形勢，結合稻米在我國居民膳食結構的特殊地位及我國研究現狀，開展我國稻米中真菌毒素污染水平和發展趨勢研究極為重要和緊迫。當前，有關真菌毒素的檢測手段在快速發展，但主要是開展一種或幾種真菌毒素的檢測研究，同時測定多種真菌毒素的報道還較少。對于稻米中真菌毒素的污染控制，除了采取相應的預防和脫毒措施外，對檢測技術也提出了更高的要求。因此，建立稻米中多種真菌毒素的同時快速檢測方法必將成為當前糧食質量安全領域的一個重要方面，只有改進和完善檢測技術，才能確保人畜健康和農產品安全。

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Research progress in aflatoxins and ochratoxin A in rice

LAI Xian-wen，ZHANG He，LIU Cheng-lan*
（Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology，Ministry of Education，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Mycotoxins are toxic metabolites produced by some filamentous fungi，which occur in foodstuffs and feeds.They have been a hazard to man and animals.The physical，chemical properties and hazard of aflatoxins and ochratoxin A were introduced.Due to the risk to human and animal health，their contamination situation，the maximum residue levels and analysis method in rice were summarized.The aim was to provide reference for mycotoxins research.

mycotoxins；aflatoxins；ochratoxin A；rice

TS55.1

A

1002-0306（2014）22-0386-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.076

2014－05－26

賴先文（1987-），男，碩士研究生，研究方向：真菌毒素污染研究。

* 通訊作者：劉承蘭（1976-），男，博士，副教授，研究方向：農產品安全。

國家自然科學基金（31071546）。