三種桂產(chǎn)桉葉油對常見致腐菌的抑制作用研究

藍亮美，馬 麗，郭占京，鄭燕菲，陳薈蕓，劉祖盛

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004）

三種桂產(chǎn)桉葉油對常見致腐菌的抑制作用研究

藍亮美，馬 麗*，郭占京，鄭燕菲，陳薈蕓，劉祖盛

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530004）

采用水蒸氣蒸餾法提取檸檬桉、窿緣桉、尾葉桉三種桂產(chǎn)桉葉揮發(fā)油，并用GC-MS對三種桉葉揮發(fā)油的化學(xué)成分進行分析；采用試管二倍稀釋法測定了三種揮發(fā)油對食品中常見致腐菌（蠟狀芽孢桿菌、姜瘟桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌、煙曲霉、黑曲霉）的最小抑菌濃度，并以亞硝酸鹽為陽性對照。結(jié)果表明：三種桉葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量有很大的差異，對供試菌種均有一定的抑制性，尤以檸檬桉葉揮發(fā)油的抑菌活性最為突出，有望應(yīng)用于食品保鮮中。

桉葉油，致腐菌，抑菌活性，食品保鮮

桉 樹（Eucalypt）為 桃 金 娘 科（Myrtaceae）桉 屬（Eucalyptus）植物，是我國3大造林樹種之一[1]。廣西是我國桉樹主要栽培區(qū)[2]。從桉葉中提取得到的桉葉油因其特殊的芳香氣味和良好的殺菌消毒作用而格外引人關(guān)注。田玉紅等[3-5]對廣西種植的桉樹精油化學(xué)成分進行了系統(tǒng)研究，指出桉葉油具有廣譜抑菌活性；葉舟[6]指出巨尾桉葉油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌活性；楊巧麗[7]也指出尾巨桉桉葉油脂對農(nóng)桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌的有抑菌活性，但對食品中常見的致腐菌還缺乏關(guān)注。

微生物引起的食物中毒至今仍威脅著人類的健康，曲霉屬微生物是主要的食品污染源，可導(dǎo)致食品發(fā)生腐敗變質(zhì)，有些還產(chǎn)生致癌真菌毒素，引起惡性腫瘤，食品保鮮日益受到人們的重視。目前使用的食品保鮮方法多使用化學(xué)合成保鮮劑，其安全性受到懷疑。天然、安全的功能性食品保鮮劑的研究開發(fā)就顯得越來越重要。利用桉葉油的抑菌活性及其特殊的香味開發(fā)新型的食品保鮮劑具有重要的意義。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了揮發(fā)油化學(xué)成分及含量，測定了檸檬桉（E.citriodora）、隆緣桉（E.exserta）、尾葉桉（E.urophylla）三種桂產(chǎn)桉樹葉揮發(fā)油對食品中常見致腐菌：蠟狀芽孢桿菌、姜瘟桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌和煙曲霉、黑曲霉的最小抑菌濃度，為桉樹葉油在食品保鮮方面的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬桉、隆緣桉、尾葉桉葉 均采自廣西大學(xué)校園 ；蠟 狀 芽 孢 桿 菌（Waxy spore bacteria）、姜 瘟 桿 菌（Jiang wen coli）、痢疾桿菌（Dysentery bacillus）、沙門氏菌（Salmonella） 由廣西中醫(yī)藥大學(xué)提供；煙曲霉（Aspergillus fumigaTus）、黑曲霉（Aspergillum niger）由廣西大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供；細菌采用牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，霉菌采用完全培養(yǎng)基[8]。

QP5050A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；YXQ.SG41 280型手提式高壓滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；KQ-600DB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；AR224CN型電子天平 OHAUS國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桉葉揮發(fā)油的提取 將新鮮葉片（已去掉葉柄）剪成1～2cm2的碎片，稱取桉葉樣品200g置于揮發(fā)油提取器中，加入800mL水，按常規(guī)水蒸氣蒸餾法提取6h[9]，靜置使油水清晰分層后取下油層備用。

1.2.2 桉葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析 桉葉揮發(fā)油成分的定性定量分析采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[3]。

氣相色譜條件：DB-1型彈性石英毛細管色譜柱（J&W Scientific，USA），規(guī)格為0.25μm×0.25μm×30m；載氣為高純氦氣；柱前壓47kPa，分流比1∶50，進樣口溫度250℃，進口溫度230℃，根據(jù)樣品的不同采用如下的升溫程序：檸檬桉、窿緣桉葉揮發(fā)油成分分析時采用的升溫程序：60℃保持1min，升至138℃（3℃/min），再升至170℃（2℃/min），繼續(xù)升至250℃（8℃/min），于250℃保持5min。

尾葉桉葉揮發(fā)油成分分析時采用的升溫程序：60℃保持1min，升至138℃（3℃/min，其中78～81℃時升溫速率為0.5℃/min），再升至170℃（2℃/min），繼續(xù)升至250℃（8℃/min），于250℃保持5min。

1.2.3 最小抑菌濃度的測定 將100μL的吐溫80定容到50mL作為揮發(fā)油的助溶劑[10]，采用試管2倍稀釋法[11-14]測定其最小抑菌濃度（MIC），取10支10mL的帶塞試管（編號1~10），將1.0mL揮發(fā)油溶液（0.2mL揮發(fā)油+0.8mL吐溫80水）加入裝有1.0mL培養(yǎng)基的1號帶塞試管中，混合均勻后從中取1.0mL加入2號試管中，將2號試管混合均勻后取1.0mL加入3號試管中，依次進行稀釋。另取10支帶塞試管（編號I~Ⅺ），往I號試管中加入1.0mL吐溫80水，依次進行二倍稀釋做空白對照。在上述試管中各加入供試菌菌懸液0.2mL，振蕩混勻后置于適宜的溫度（細菌在37℃恒溫培養(yǎng)24h，霉菌在28℃恒溫培養(yǎng)48h）下培養(yǎng)。觀察結(jié)果，以完全沒有菌生長的最低濃度的平均值為該揮發(fā)油的最小抑菌濃度MIC，以亞硝酸鹽為抑菌實驗陽性對照，重復(fù)測定3次。根據(jù)下列公式計算出各桉葉揮發(fā)油溶液的最小抑菌濃度（MIC）：

MIC=C/2n

式中，C為加入揮發(fā)油的原始濃度；n為完全沒有菌生長的試管編號。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC的測定結(jié)果

由表1可見，三種桉葉揮發(fā)油對各種供試菌的最小抑菌濃度各不相同，其中檸檬桉葉揮發(fā)油對各種供試菌均表現(xiàn)出最強的抑菌性，最小抑菌濃度MIC低至0.08061mg/mL，對各種供試菌的抑菌活性大小為：蠟狀芽孢桿菌＞姜瘟桿菌＝痢疾桿菌＝煙曲霉＞沙門氏菌＝黑曲霉。窿緣桉葉揮發(fā)油對沙門氏菌的抑菌作用最強（MIC＝1.340mg/mL），對實驗菌的抑菌活性大小為：沙門氏菌＞蠟狀芽孢桿菌＝煙曲霉＞姜瘟桿菌＞痢疾桿菌＝黑曲霉。尾葉桉葉揮發(fā)油對沙門氏菌的抑菌作用最強，MIC為0.6746mg/mL，與檸檬桉葉揮發(fā)油對沙門氏菌的MIC（MIC＝0.6448mg/mL）相當(dāng)，對各種供試菌的抑菌活性大小為：沙門氏菌＞蠟狀芽孢桿菌＞痢疾桿菌＝煙曲霉＝黑曲霉＞姜瘟桿菌。亞硝酸鹽對各種供試菌的MIC均大于1mg/mL，亞硝酸鹽對黑曲霉的抑菌活性最弱，MIC為75.00mg/mL。由此可見三種桉葉揮發(fā)油對各種供試菌的抑菌活性大小為：檸檬桉＞窿緣桉＝尾葉桉＞亞硝酸鹽。

圖1 檸檬桉桉葉揮發(fā)油成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the volatile compounds from leaves of E.citriodora

表1 桉葉揮發(fā)油對各種供試菌的最小抑菌濃度（mg/mL）Table 1 The MIC of the volatile oil to tested strains in Eucalyptus（mg/mL）

2.2 三種桉葉揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

按上述氣相色譜-質(zhì)譜條件分別對三種桉葉揮發(fā)油樣品的化學(xué)成分進行分析，得到樣品的總離子流色譜圖和各峰質(zhì)譜圖（圖1~圖3）。采用計算機對各峰的質(zhì)譜圖進行NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律進行核對，參考標(biāo)準(zhǔn)圖譜和相關(guān)文獻確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用峰面積歸一法計算各組分的相對含量，已鑒定的化合物含量占總峰面積大于2.0%，如表2~表4所示。

從檸檬桉葉揮發(fā)油樣品中鑒定出含量占總峰面積大于2.0%的有6種化合物，占揮發(fā)油含量的89%以上 ：其 中 醇 類 物 質(zhì) 3種 ：桉 樹 腦（2.39%）、香 茅 醇（2.45%）和異蒲勒醇（5.26%），占總峰面積的10.1%；醛類物質(zhì)主要是香茅醛，占總峰面積的39.20%，酯類物質(zhì)2種：丁酸玫瑰酯（21.04%）和乙酸香茅酯（18.96%），占總峰面積的40.0%。

圖2 窿緣桉葉揮發(fā)油成分的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of the volatile compounds from leaves of E.exserta

圖3 尾葉桉葉揮發(fā)油成分的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of the volatile compounds from leaves of E.urophylla

從窿緣桉葉揮發(fā)油樣品中鑒定出含量占總峰面積大于2.0%的有6種化合物，占揮發(fā)油含量的80%以上。其中碳氫化合物3種：a-蒎烯（18.06%）、β-蒎烯（8.48%）和3-蒈烯（5.27%），占總峰面積的31.81%；醇類物質(zhì)3種：桉樹腦（38.79%）、松香芹醇（7.07%）和羅勒烯醇（2.42%），占總峰面積的48.28%。

從尾葉桉葉揮發(fā)油樣品中鑒定出含量占總峰面積大于2.0%的有5種化合物，占揮發(fā)油含量的86%以上。其中碳氫化合物主要是反式羅勒烯，占總峰面積的20.31%，醇類物質(zhì)3種：1，4-桉樹腦（47.30%）、松油醇（7.80%）和茨醇（4.08%），占總峰面積的59.18%；酮類物質(zhì)主要是茉莉酮占總峰面積的7.09%。如圖4所示。

表2 檸檬桉葉精油的主要化學(xué)成分及相對含量Table 2 The main chemical constituents and relative content of essential oils of leaves from E.citriodora

表3 窿緣桉葉精油的主要化學(xué)成分及相對含量Table 3 The main chemical constituents and relative content of essential oils of leaves from E.exserta

表4 尾葉桉葉精油的主要化學(xué)成分及相對含量Table 4 The main chemical constituents and relative contentof essential oils of leaves from E.urophylla

據(jù)報道[15-18]植物揮發(fā)油的抑菌活性與揮發(fā)油中的醛類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)及其他一些小分子的 萜 烯 類 物 質(zhì) 有 關(guān) 。 萬 素 英 等[19]研 究 證 明 ，各 種 酚類、脂肪酸酯類化合物均對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用。胡林峰等[20]研究表明了植物揮發(fā)油中的醇、醛、酮以及酚類化合物具有開發(fā)為抑菌活性成分的潛力。戰(zhàn)廣琴等[21]研究揭示香茅醛的抗霉機理。呂慧[22]研究指出桉樹腦、a-蒎烯、羅勒烯具有一定的抑菌效果。吳建挺[23]研究發(fā)現(xiàn)香茅醇能引起灰葡萄孢絲形態(tài)的畸形、原生質(zhì)凝結(jié)核內(nèi)含物外溢等現(xiàn)象。本實驗中利用GC-MS測得桉葉揮發(fā)油中含有較高含量的香茅醛、乙酸香茅酯、桉樹腦、羅勒烯、a-蒎烯等活性成分，可見桉葉揮發(fā)油對食品中常見致腐菌具有較好的抑菌性與香茅醛、乙酸香茅醛、桉樹腦、羅勒烯、a-蒎烯等活性成分有關(guān)。

圖4 三種桂產(chǎn)桉葉揮發(fā)油的主要化學(xué)成分Fig.4 The main chemical constituents of essential oils of leaves from three kinds of eucalyptus

3 結(jié)論

三種桉葉揮發(fā)油對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌效果，抑菌活性大小為：檸檬桉＞窿緣桉＝尾葉桉＞亞硝酸鹽，其中檸檬桉葉揮發(fā)油對實驗菌最小抑菌濃度MIC低至0.08061mg/mL。

三種桉葉揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量有明顯的差異，檸檬桉葉揮發(fā)油中含有較高含量的香茅醛、乙酸香茅酯和丁酸玫瑰酯，占揮發(fā)油含量79%以上，且抑菌性最強，說明香茅醛、乙酸香茅酯和丁酸玫瑰酯共同具有較好的抑菌性；窿緣桉葉揮發(fā)油中含有較高含量的桉樹腦、蒎烯類化合物；尾葉桉葉揮發(fā)油中含較高的桉樹腦、反式羅勒烯等化合物，說明了植物揮發(fā)油的抑菌活性機理是蒎烯類、萜烯類物質(zhì)等共同作用的結(jié)果。

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Study on major components and antimicrobial activities of volatile oil extracted from three kinds of eucalyptus leaves

LAN Liang-mei，MA Li*，GUO Zhan-jing，ZHENG Yan-fei，CHEN Hui-yun，LIU Zu-sheng
（College of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University，Nanning 530004，China）

Three kinds of volatile oil were extracted from Eucalyptus lemon ， Eucalyptus exserta ， Eucalyptus urophylla with steam distillation respectively and the components of the oils were analyzed by GC-MS.The antimicrobial effects of the oil against foodborne pathogens were tested using double dilution method and the nitrite was used as positive control substance.The results showed that there were big difference between the chemical composition and content of three kinds of volatile oil.Three kinds of Eucalyptus essential oil had certain inhibition activity on the test bacteria and the antimicrobial activity of lemon eucalyptus essential oil was remarkable.Eucalyptus essential oil had good bacteriostatic effect and had application prospect in food preservation.

essential oil；pathogers；antibacterial activity；food preservation

TS205.9

A

1002-0306（2014）22-0155-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.025

2014－03－14

藍亮美（1990-），女，大學(xué)本科，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

* 通訊作者：馬麗（1971-），女，高級工程師，研究方向：天然產(chǎn)物化工。

廣西區(qū)科技攻關(guān)項目（桂科攻1099061-2）；廣西大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”資助項目（120103）。