長裙竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取物的化學組成分析及抑菌活性研究

鄧 超，付海田，谷 鵬，胡 準，陳敬華，*

（1.江南大學無錫醫學院，江蘇無錫 214122，2.江南大學藥學院，江蘇無錫 214122）

長裙竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取物的化學組成分析及抑菌活性研究

鄧 超1，付海田2，谷 鵬2，胡 準2，陳敬華2，*

（1.江南大學無錫醫學院，江蘇無錫 214122，2.江南大學藥學院，江蘇無錫 214122）

依次用乙醚和乙酸乙酯為溶劑，對正己烷提取后的長竹蓀子實體粉末進行索氏提取。乙醚和乙酸乙酯的提取率分別為1.57%和1.85%，然后采用GC-MS對乙醚和乙酸乙酯提取物的化學成分進行分析，圖譜解析結果顯示乙醚提取物中含有43種成分，占總含量的99.98%；乙酸乙酯提取物中含有73種成分，占總含量的99.56%。兩種提取物對金黃色葡萄球菌、變形桿菌、枯草芽孢桿菌、傷寒桿菌等均有明顯的抑制作用，而乙酸乙酯提取物的抑菌效果優于乙醚。

長裙竹蓀，乙醚，乙酸乙酯，化學成分，抑菌活性

竹蓀又名竹蓀、竹笙、竹參，是著名的食用真菌，具有香氣濃郁、脆嫩爽口、味道鮮美的特點，被譽為“菌中皇后”。它隸屬于真菌界、擔子菌亞門、腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬。據報道，該屬目前共有12個種和變種[1-2]。從竹蓀提取的有效成分對防癌、抗炎、抗氧化、降血脂等均具有明顯療效[3-6]。此外，竹蓀還具有特異的防腐作用，能夠抑制微生物的生長[7-9]。同時，對從長裙竹蓀中提取的脂溶性組分的分析表明，其含有羧酸類，苷類，喹唑啉類，醛酮類，酰胺類化合物等成分[10]。本實驗室的前期研究表明，竹蓀子實體正己烷提取物含有55種組分，其中23種成分是首次從竹蓀屬中檢測出來，其主要成分為：羧酸、醇、酮、倍半萜、芳香烴、酯等，并且正己烷提取物對傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌和枯草芽孢桿菌有很好的抑制作用[11]。本文將在前期工作的基礎上，對正己烷提取后的竹蓀子實體粉末依次用乙醚和乙酸乙酯進行索氏提取，然后采用GC-MS對提取物進行組分分析，并對其抑菌活性進行初步研究，為進一步開發利用長裙竹蓀資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長裙竹蓀（Dictyophora indusiata）子實體干品 由廣東無限極公司提供；正己烷、乙醚、乙酸乙酯、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、玉米粉、黃豆粉、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、CaCl2、VB1、CMC-Na、NaCl、瓊脂 均購于國藥集團化學試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、變形桿菌（Bacterium vulgare）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、傷寒桿菌（Salmonella typhosa）、啤 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae）、黑 根霉（Rhizopus nigricans）、總狀毛霉（Mucor racemosus）由江南大學藥學院微生物實驗室提供。

電子天平 梅特勒托利多儀器上海有限公司；HH-8型數顯恒溫水浴鍋 金壇市鑫鑫實驗儀器廠；索氏提取器 江蘇金壇市國瑞實驗儀器廠；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋、生物潔凈工作臺 上海博訊實業有限公司；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司；QP2010s型氣質聯用色譜儀 島津國際貿易（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取流程 流程圖[11-13]見圖1。

圖1 竹蓀子實體脂溶性成分的提取流程Fig.1 Extraction procedure of lip-soluble composition from the fruiting body of D.indusiata

1.2.2 提取方法 將竹蓀子實體干品剪碎后，放入組織粉碎機內粉碎成粉末狀，過80目篩，稱取一定量的粉末用濾紙包裹住，置于索氏提取器中，按照料液比1∶50（g∶mL）依次分別用正己烷、乙醚和乙酸乙酯進行冷凝回流萃取，收集乙醚和乙酸乙酯萃取液過濾，濾液用旋轉蒸發儀減壓濃縮至恒重，置具塞試管中4℃保存備用。

1.2.3 竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取物的分離鑒定 將低溫保存的竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取濃縮液分別用相對應的溶劑作適量稀釋。用島津GC-MS QP2010s進行分析，NIST08和NIST08s數據庫進行檢索和分析，確定各組分成分，氣相色譜峰面積歸一法計算其各組分含量。

氣相條件：Rxi-1ms柱（30m×0.25mm×0.25um）。柱溫采用程序升溫：初始溫度120℃，保持2min，以3℃/min升溫至180℃保持1min，以10℃/min升溫至220℃保持5min，以20℃/min升溫至280℃保持25min。分流比10∶1，柱流量1.0mL/min，進樣量1.0μL。

質譜條件：70eV的EI源，離子源溫度200℃，溶劑延遲時間為1.8min，m/z范圍為50~750。

1.2.4 抑菌實驗

1.2.4.1 培養基的配制 真菌培養基（%）：PDA培養基，含土豆20，葡萄糖2，瓊脂2，pH自然。馬鈴薯去皮切成小塊煮至用玻棒可以戳碎為止，用雙層紗布過濾取汁，加葡萄糖和瓊脂溶化，補水至100mL。

細菌培養基（%）：營養瓊脂培養基，牛肉膏0.3、蛋白胨1.2、NaCl 0.5、瓊脂1.5，pH 7.2~7.4。

液體發酵培養基（%）：CMC-Na 0.5、葡萄糖2、玉米粉1、黃豆粉1、酵母膏0.2、MgSO40.15、KH2PO40.3、CaCl20.1、VB10.1。

1.2.4.2 培養基平板制備 將配制好的各種菌株的培養基及培養皿置于高壓蒸汽滅菌器內，121℃滅菌30min，取出后培養基冷卻至50℃，無菌操作傾注于培養皿內，每皿15~20mL。

1.2.4.3 供試菌株的準備 在無菌操作臺中將供試菌種接入相對應的試管斜面培養基進行活化，細菌置37℃恒溫培養箱內培養18h，霉菌25℃、酵母菌30℃培養48h。

1.2.4.4 供試菌株懸液的制備及平板接種 用接種環挑取少許霉菌孢子、啤酒酵母于裝有5mL無菌水的試管內，制成菌株懸液。霉菌孢子、啤酒酵母用血球計數板計數。用接種環挑取一環細菌于5mL液體培養基中37℃培養6~8h，用梯度稀釋法計數。調整菌株懸液的濃度至含孢子或菌體為106~107/mL。

1.2.4.5 供試樣品的配制 分別用相應溶劑將竹蓀乙醚和乙酸乙酯提取物濃縮液稀釋0、2、4倍。

1.2.4.6 抑菌實驗 采用瓊脂平板打孔法。分別吸取菌懸液0.1mL用滅菌玻璃涂棒涂布于培養皿的固體培養基上，靜置片刻，然后在平皿中用滅菌不銹鋼打孔器打孔，打孔器直徑6mm。用移液器吸取0.5mL不同稀釋倍數的竹蓀乙醚和乙酸乙酯提取物濃縮液，注入已打好的圓孔內。霉菌25℃培養48h，酵母菌30℃培養48h，細菌37℃培養18h后測量抑菌圈直徑，每個組合三個重復，以無菌水做空白對照，相應溶劑做陰性對照。

1.2.4.7 最低抑菌濃度（MIC）的測定[14]依據連續稀釋法，分別將乙醚和乙酸乙酯提取液（原液濃度為140.00mg/mL）稀釋后，加入培養基中混勻，在平板上涂布0.1mL菌體懸液，于37℃培養18h，觀察菌株生長情況。以平板中沒有菌生長的最低濃度為提取液對該菌株的最低抑菌濃度（MIC）。

1.3 數據處理

統計學處理結果以平均數±標準誤表示，采用SPSS 13.0軟件中的單因素方差分析進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 長裙竹蓀乙醚和乙酸乙酯提取物性質及提取率

乙醚提取物的得率為1.57%，呈淡黃色油狀液體，pH4.0，呈清淡香味。乙酸乙酯提取物的得率為1.85%，呈黃褐色油狀液體。

2.2 乙醚和乙酸乙酯提取物的化學成分解析

從長裙竹蓀子實體粉末乙醚提取物和乙酸乙酯提取物中分別鑒定出43種和73種組分，占總量的99.98%和99.56%。乙醚提取物和乙酸乙酯提取物的GC-MS總離子色譜圖見圖2、圖3，化學成分檢測結果見表1、表2。

表1 長裙竹蓀子實體乙醚提取物化學成分鑒定表Table 1 Chemical compositions of D.indusiata extracted with ethylether

從表1可知，長裙竹蓀子實體的乙醚提取物中，檢測出的主要化學成分類別及相對含量為：苷類33.27%、脂 肪 酸 類13.24% 、醛 酮 類13.72%、芳 香 類8.79%、醇類17.85%、酯類7.19%、酰胺類4.89%。其中占總提取物的32.76%的是4-硝基苯基-2，3，4，6-四乙酸基-β-D-吡喃葡萄糖苷，是首次從竹蓀屬中檢測到。脂肪酸類、芳香類和酯類種類最多，分別有7、7和11種，占總檢測組分含量的29.22%，占總組分種類的58.14%；13.72% 的 醛 酮 中 ，呋 喃 酮 占72.81% ；13.24%的脂肪酸中，不飽和脂肪酸占60.87%。表2結果顯示，長裙子實體的乙酸乙酯提取物中，共檢測出73種化學物質。其中醇類的種類和含量均最多，有16種，占檢出物質含量的34.22%，1-三十一烷醇是首次從竹蓀屬中檢測到，占總提取物的9.35%。其他含量較多的為脂肪酸類，共檢出10種，占檢出物質含量的23.55%。檢出醛酮類有11種占總含量的20.89%、酯類11種占總含量10.56%、烴類12種占總含量的5.84%、芳香類6種占總含量3.19%、酚類及其他共占1.65%。綜合分析表明，從長裙竹蓀子實體粉末乙醚和乙酸乙酯提取物中共分離鑒別出116種化合物，其中有33種化合物是首次從竹蓀屬中分離鑒別出來的，其主要成分為苷類、脂肪酸類、醇類、醛酮類、酯類等。乙醚提取物和乙酸乙酯提取物中上述主要成分分別占94.06%，89.22%。

圖2 長裙竹蓀子實體乙醚提取物的GC-MS總離子色譜圖（35℃）Fig.2 GC-MS Total ion chromatogram of D.indusiata with ethylether at 35℃

圖3 長裙竹蓀子實體乙酸乙酯提取物的GC-MS總離子色譜圖（35℃）Fig.3 GC-MS Total ion chromatogram of D.indusiata with ethyl acetate at 35℃

表2 長裙竹蓀子實體乙酸乙酯提取物化學成分鑒定表Table 2 Chemical compositions of D.indusiata extracted with ethyl acetate

據文獻報道，目前從植物、真菌中提取出的有抑菌活性成分主要為脂肪酸類、酯類、醇類、醛酮類、酚類和苷類等，其抑菌機制主要是通過破壞細胞壁及細胞膜的完整性和抑制蛋白、核酸的合成等途徑實現的[15]。其中脂肪酸及其衍生物可抑制絲狀真菌以及酵母菌的生長，同時也可抑制細菌的生長繁殖，并且對革蘭陽性細菌的抑制作用強于革蘭陰性細菌，但存在菌株差異性。對鼠傷寒沙門菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、肉桿菌等其他常見致腐致病細菌也有一定的抑制作用[16]。相應的酯類也具有類似的抑菌活性，并且含有不飽和結構的酯類的抑菌效果較飽和酯類更高，且對革蘭氏陽性菌的抑制作用優于革蘭氏陰性菌[17]。此外不同類型的化合物的抑菌效果也有所差異，如隱丹參酮對金黃色葡萄球菌高度敏感[18]，而黃酮類對大腸桿菌和沙門氏菌抑菌效果較好[19]。醇類（包括甾醇類）對金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌和蘇門芽孢桿菌等有抑菌效果[20]。酚類物質的抑菌作用不僅限于細菌，對于酵母和霉菌也有效果[21]。醛類，如肉桂醛，已作為食品添加劑用來防腐殺菌，在較低濃度時，即可對黃曲霉、黑曲霉、酵母、白地霉等均有強烈的抑菌效果[22]。而在苷類中，苷元的抑菌效果高于糖苷，如金線蓮中提取出來的丁酸衍生物葡萄糖苷抑菌效果不明顯[23-24]。本實驗中，長裙竹蓀子實體粉末乙醚和乙酸乙酯提取物的主要成分為苷類、脂肪酸類、醇類、醛酮類、酯類等，根據上述文獻分析，其應當對微生物的生長有抑制作用，因此，擬通過抑菌實驗來進一步驗證提取物的抑菌功效，并且比較兩種提取物抑菌作用的差異。

續表

2.3 提取物抑菌作用

從表3可見，與空白對照組和溶劑對照組比較，樣品組的抑菌圈直徑有高度顯著性差異（p＜0.01）。長裙竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取物對細菌的生長有明顯的抑制作用，其抑菌效果隨濃度遞減而降低，三種濃度下均對傷寒桿菌的抑菌效果最好，其次為金黃色葡萄球菌、變形桿菌和枯草芽孢桿菌，可見提取物對致病菌的抑制效果優于非致病菌。在兩種提取物中，高濃度和中濃度的乙酸乙酯提取物對致病菌的抑制作用大于相同濃度的乙醚提取物，低濃度的兩種提取物對致病菌的抑制作用無顯著差異。而對于非致病菌，各個濃度的兩種提取物的均無顯著差異。此外，乙醚和乙酸乙酯提取物對總狀毛霉、黑根霉、酵母菌等真菌的生長均沒有抑制作用。本研究所選菌種中包含致病性革蘭氏陽性無芽胞菌，致病性革蘭氏陰性無芽胞菌，非致病性革蘭氏陰性芽孢桿菌，非致病性革蘭氏陰性無芽孢桿菌以及單細胞和多細胞真菌，長裙竹蓀子實體粉末乙醚和乙酸乙酯提取物對細菌生長具有廣泛的抑制作用，尤其是致病菌，而對真菌無抑制作用，這與譚敬軍等[8]對長裙竹蓀乙酸乙酯、丙酮、乙醇提取物的抑菌實驗結果一致。但棘托竹蓀的提取物[12-13，25]對霉菌、酵母菌、細菌都有效果，特別是乙酸乙酯提取物對霉菌和酵母菌的效果比對細菌要明顯，說明不同種的竹蓀提取物所含成分不同，其生物活性亦有差異。

2.4 提取物對各細菌菌株的MIC

表4結果顯示，長裙竹蓀子實體的乙醚提取物和乙酸乙酯提取物對傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC均為8.75mg/mL，對變形桿菌、枯草芽孢桿菌的MIC均為17.50mg/mL。

表3 長裙竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取物的抑菌實驗結果Table 3 Antimicrobial activity of the extractions with ethylether or ethyl acetate from fruiting body of D.indusiata

表4 長裙竹蓀子實體乙醚和乙酸乙酯提取物對4種受試細菌的最小抑菌濃度測定Table 4 Determination of MIC of four kinds of bacteria by the extractions with ethylether or ethyl acetate from fruiting body of D.indusiata

3 結論

由于長裙竹蓀乙醚和乙酸乙酯提取物的化學組分以及抑菌效果的比較研究尚未有文獻報道，本實驗對長裙竹蓀兩種有機溶劑的提取物進行了對比研究。GC-MS分析結果表明，從長裙竹蓀子實體粉末乙醚和乙酸乙酯提取物中共分離鑒別出116種化合物，其中有33種化合物是首次從竹蓀屬中分離鑒別出來的，其主要成分為苷類、羧酸類、醇類、醛酮類、酯類等。乙醚提取物和乙酸乙酯提取物中上述主要成分分別占有94.06%，89.22%。抑菌實驗顯示，兩種提取物對細菌生長具有廣泛的抑制作用，尤其對致病菌的作用更加顯著，而對真菌（包括單細胞真菌和多細胞真菌）無抑制作用。MIC測定結果表明，長裙竹蓀子實體的乙醚提取物和乙酸乙酯提取物對傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC均為8.75mg/mL，對變形桿菌、枯草芽孢桿菌的MIC均為17.50mg/mL。綜上可知，長裙竹蓀乙醚和乙酸乙酯提取物都含有天然抑菌成分，特別是對致病菌的作用值得關注。但有機溶劑提取物的化學組成復雜，哪種（或哪幾種）成分具有更強的抑菌效果及提取物的抑菌機理有待進一步深入研究。長裙竹蓀乙醚和乙酸乙酯提取物作為天然產物與化學合成的防腐劑相比，具有無毒，綠色環保的優勢，隨著對長裙竹蓀抑菌活性更深入系統的研究，有望開發出基于竹蓀提取物的新型天然防腐劑，在食品防腐領域有廣泛的應用前景。

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Chemical composition and antimicrobial activity of the extracts with ethylether and ethyl acetate from Dictyophora indusiata

DENG Chao1，FU Hai-tian2，GU Peng2，HU Zhun2，CHEN Jing-hua2，*
（1.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The dry fruiting body power of Dictyophora indusiata was extracted by ethylether and ethyl acetate after n-hexane extraction.The ethylether and ethyl acetate extraction rate was 1.57%and 1.85% ，respectively. The chemical composition of the extracts had been identified by GC-MS.The analysis results showed that forty-three components had been identified from ethylether extracts and their content was of 99.98%.Seventythree components had been identified from ethyl acetate extracts and their content was of 99.56%.Two kinds of extraction showed a significant antimicrobial activity to Staphylococcus aureus，Bacterium vulgare，Bacillus subtilis and Salmonella typhosa.The inhibitory effect of ethyl acetate extracts were better than that of ethylether extracts.

Dictyophora indusiata；ethylether；ethyl acetate；chemical composition；antimicrobial activity.

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0128-07

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.020

2014－03－14

鄧超（1972-），男，在讀博士，講師，主要從事天然產物的提取及活性評價方面的研究。

* 通訊作者：陳敬華（1971-），男，博士，教授，主要從事生物活性大分子及生物醫用材料方面的研究。

教育部博士點基金（博導類20110093110008）。