紫玉米籽粒花青素粗提液抗氧化活性研究

朱 敏，史振聲，李鳳海

（沈陽農業大學特種玉米研究所，遼寧沈陽 110866）

紫玉米籽粒花青素粗提液抗氧化活性研究

朱 敏，史振聲，李鳳海

（沈陽農業大學特種玉米研究所，遼寧沈陽 110866）

以不同基因型紫玉米籽粒中提取的花青素粗提液為研究對象，分析比較紫玉米籽粒總酚、花青素的相對含量。并對提取物的還原能力、清除超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力進行測定，同時分析了紫玉米籽粒中總酚和花青素含量與體外抗氧化性的關系。結果表明，不同紫玉米品種花青素、總酚含量、還原力及清除羥基自由基和超氧陰離子自由基能力存在顯著的基因型差異，其中FS7011花青素、總酚含量最高。紫玉米籽粒花青素和總酚含量與其還原力、清除羥基自由基及超氧陰離子自由基能力呈顯著正相關。紫玉米富含花青素，具有較強的抗氧化作用，可用于開發天然抗氧化劑。

紫玉米，總酚，花青素，抗氧化活性

紫玉米（purple corn）是玉米的一個常規品種，素有“黃金食品”之稱，其蛋白質、脂肪、礦物質含量均高于普通玉米。此外，紫玉米種皮富含花色苷類化合物，是天然色素的主要來源。花青素，又稱花色素，是一種廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物，主要存在于植物細胞液泡中，在不同的pH條件下，呈現五彩繽紛的顏色[1]。花青素作為一種天然食用色素，安全、無毒、并且資源豐富，具有一定的營養和藥理作用，在食品、化妝品、醫藥等行業有著巨大的應用前景。

趙曉燕等[2]認為花青素具有抗氧化、抗突變、延緩衰老、預防心腦血管疾病等多種生理功能。花青素的酚羥基結構使其對活性氧等自由基具有很強的捕捉能力，因而具有較好的生理活性。姜平平等[3]對紫甘薯花青素抗氧化活性研究得出，紫甘薯花青素在模型中表現出相當的還原力和清除羥基自由基的能力，并且與花青素濃度呈正相關。徐金瑞等[4]對黑大豆花青素含量與總抗氧化能力之間的相關性進行了分析，結果認為二者之間存在極顯著的正相關性（p＜0.01），且黑大豆種皮花色苷提取物表現出較強的清除·OH、O2-·及有機自由基DPPH·的體外抗氧化作用。周波[5]通過體外實驗測定玉米紫色植株花色苷色素在Fe2+引發的卵磷脂脂質體體系中抗氧化活性，得出紫色植株色素對脂質過氧化有明顯的抑制作用，抑制率隨樣品的濃度增高而增大。本實驗以從不同基因型紫玉米籽粒中提取的總酚、花青素粗提液為研究對象，分析比較總酚、花青素含量，測定花青素的還原能力、抗脂質過氧化能力、清除超氧陰離子自由基、羥基自由基的能力，同時分析了紫玉米籽粒中總酚和花青素含量與體外抗氧化性的關系，旨在評價不同基因型紫玉米可能的抗氧化生理活性，為篩選抗氧化能力強、總酚和花青素含量高的紫玉米種質資源，開發天然抗氧化劑提供理論和應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料 本實驗采用6個不同基因型紫玉米品種為原料，分別為ZS7511、ZS7615、ZF7139、FS7011、SF9538、FG5701 均由沈陽農業大學特種玉米研究所提供；磷酸鹽、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、無水乙醇 均為分析純。

721型分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；電熱恒溫培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；電熱恒溫干燥箱 鄭州長城科工貿有限公司；恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司；分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；雷磁pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2 紫玉米籽粒花青素粗提液的制備

取紫玉米品種籽粒粉碎過60目篩，準確稱取10.0g，用5%HCl與無水乙醇按1∶1混合作為提取劑，在60℃水浴中提取5h，過濾，分別取濾液1、2、3、4、5mL，用相同的提取劑定容至50mL，配制不同濃度的花青素樣品粗提液備用[6]。

1.2.1 花青素的測定 用721型分光光度計測定不同濃度的花青素樣品液在波長526nm處的吸光值A526nm。根據比爾定律，以吸光值表示提取液中花青素的相對含量。

1.2.2 總酚含量的測定

1.2.2.1 沒食子酸標準曲線的繪制 于10mL試管中一次加入1mL不同濃度梯度的沒食子酸標準品（GAE）、1mL稀釋3倍的福林酚試劑盒5mL 4%NaCO3溶液，于25℃水浴中放置30min，在765nm處測吸光度值，得GAE濃度與吸光值的回歸方程：C（mg/L）= 8.3072A-0.08567（相關系數R=0.998）。

1.2.2.2 樣品的測定 樣品管以1mL樣品代替沒食子酸，參比管以1mL蒸餾水代替樣品液，其余操作與上述標準管步驟相同。在765nm處測吸光度值，由標準曲線方程計算樣品的總酚含量（以沒食子酸計）。

1.2.3 還原能力的測定 采用普魯士藍法[7]測定天然色素的還原能力。取一定濃度的樣品溶液0.5mL，分 別 加 入 2.5mL 0.2mol/L pH6.6 的 磷 酸 鹽 緩 沖 液 和2.5mL 1%的K3Fe（CN）6溶液，并混合均勻，將混合液在50℃水浴條件下保溫20min后，迅速冷卻，再向反應體系中加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和1mL 0.1%的三氯化鐵，搖勻，10min后700nm下測定吸光值A700。用吸光值表示樣品的還原能力。

1.2.4 抑制超氧陰離子能力的測定 采用鄰苯三酚法[7]測定天然色素抑制超氧陰離子的能力。

1.2.4.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定 向10mL試管中加入4.5mL 0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液，同時加入1mL雙蒸水，于25℃下恒溫水浴20min，再加入3mL 25℃下預熱的鄰苯三酚溶液，迅速搖勻，倒入1cm的比色杯內，420nm波長處比色，每隔30s記錄1次吸光值A420，將鄰苯三酚自氧化速率控制在0.06mL/min左右。反應3min后，加1滴10mmol/L的HCl終止反應，靜置5min后測得吸光值定為A0，可表示鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.4.2 樣品抑制鄰苯三酚自氧化的能力 在10mL試 管 中 加 入4.5mL 0.05mol/L pH8.2 的Tris-HCl緩 沖液，加入1mL樣品，25℃下平衡4min，再按上述方法，測定鄰苯三酚的自氧化速率，得到吸光值A1，同時作一試劑空白A2，依下式計算樣品對鄰苯三酚自氧化的抑制能力：抑制率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100。

1.2.5 羥基自由基清除能力的測定 參照金鳴等[8]的方法略有改動。取1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲于具塞試管中，依次加入2mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液和1mL蒸餾水，充分混勻后，再加入1mL 0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液和1mL 0.01%H2O2，于37℃水浴60min，在536nm測其吸光值，所測得的數據為損傷的吸光度A0。未損傷管以1mL蒸餾水代替損傷管中的1mL 0.01%的H2O2，操作方法同損傷管，可測得536nm未損傷管的吸光度A1。樣品管以1mL樣品代替損傷管中的 1mL 0.01% 的 H2O2，操 作 方 法 同 損 傷 管 ，可 測 得536nm樣品管的吸光度A2，則樣品對羥自由基的抑制率S可由下式計算：S（%）=（A2－A0）/（A1－A0）×100。

1.3 統計分析

花青素和總酚含量與還原力、清除超氧陰離子自由基及羥基自由基能力之間的相關分析采用相關系數法。數據采用DPS7.0統計分析軟件進行數據處理和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同基因型紫玉米籽粒中花青素含量的比較

圖1 不同濃度樣品液中花青素含量的比較Fig.1 Anthocyanin content of different purple corn kernel extract

不同基因型紫玉米籽粒不同濃度樣品液中花青素的相對含量變化見圖1，不同濃度的花青素反應體系中，隨著樣品液加入量的增加，反應液的吸光值不斷增加。根據比爾定律說明，花青素的含量逐漸增多。ZF7193和FS7011花青素的含量要顯著高于其他紫玉米品種，FG5701籽粒花青素含量最少，隨著樣品加入量的增加，吸光值變化幅度較小。

2.2 不同基因型紫玉米籽粒中總酚的比較

不同濃度花青素樣品液中總酚含量如圖2所示。總酚和花青素的含量變化趨勢一致，隨著樣品加入量的增加，總酚含量逐漸增大，ZF7193和FS7011色素液中總酚的含量要顯著高于其他紫玉米品種，6個紫玉米品種籽粒總酚含量：FS7011＞ZF7139＞ZS7511＞ZS7615＞SF9538＞FG5701。

圖2 不同濃度樣品液中總酚含量的比較Fig.2 Phenolic content of different purple corn kernel extract

2.3 不同基因型紫玉米籽粒中花青素粗提液還原能力的比較

一般來說，樣品的還原能力與其抗氧化活性之間具有顯著的相關性，還原能力的高低可以間接反映樣品抗氧化能力的強弱。本實驗對6個不同基因型紫玉米籽粒花青素提取液的還原能力進行了測定，并進行了比較，結果如圖3所示。根據還原力測定的實驗原理可知，在波長700nm處測定的吸光值越大，表明其還原能力越強。6個不同基因型紫玉米籽粒花青素提取液的還原能力隨濃度的增加而增強。FS7011還原力的變化幅度最大，ZS7615的變化幅度最小，當加入5mL樣品液時，ZS7615色素液還原力為1.665，FG5701色素液還原力為1.6564，FS7011為1.659，ZF7139為1.655，ZS7511與SF9538均為1.652，表明6種紫玉米籽粒花青素提取液均具有一定的還原能力，且還原能力強弱為ZS7615＞FG5701＞FS7011＞ZF7139＞ZS7511=SF9538。

圖3 不同濃度樣品液還原能力的比較Fig.3 Reducing power of different purple corn kernel extract

2.4 不同基因型紫玉米籽粒中花青素粗提液抑制超氧陰離子能力的比較

超氧陰離子自由基是一種氧自由基，與多種疾病有密切關系，可以通過一系列反應生成其他氧自由基，因此，研究其清除能力具有特別的意義。鄰苯三酚在堿性條件下能夠迅速發生自氧化，釋放出超氧陰離子，在加入清除劑后能迅速清除自氧化產生的超氧陰離子自由基，從而降低鄰苯三酚的自氧化速率。本實驗采用鄰苯三酚自氧化法測定了6個紫玉米品種籽粒色素液對鄰苯三酚自氧化過程中產生的超氧陰離子的清除能力，由圖4可以看出，在實驗的5個濃度梯度范圍內，6個紫玉米籽粒色素液對鄰苯三酚自氧化產生的超氧陰離子的清除能力隨濃度的增加而增強。當加入5mL樣品液時，FS7011清除超氧陰離子自由基的能力最大為74.04%，ZS7615最小為65.01%。6種紫玉米籽粒花青素提取液對超氧陰離子自由基都有一定的清除能力，清除能力大小為：FS7011＞SF9538＞FG5701＞ZF7139＞ZS7511＞ZS7615。

圖4 不同濃度樣品液對超氧陰離子自由基清除率的比較Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activities of different purple corn kernel extract

2.5 不同基因型紫玉米籽粒中花青素粗提液清除羥基自由基能力的比較

6種不同基因型紫玉米籽粒粗提物清除羥基自由基能力見圖5，從圖5可以得出不同紫玉米籽粒粗提物對羥基自由基的清除能力不同。在實驗濃度范圍內，為了便于比較，采用加入1mL樣品液時作圖，由圖5可知，樣品中花青素對羥基自由基清除能力最強的是ZS7615，對羥基自由基清除率為98.4%，最弱的為FG5701，清除率為67.6%。6種紫玉米籽粒花青素提取液對羥基自由基清除能力大小為：ZS7615＞ZF7139＞ZS7511＞FS7011＞SF9538＞FG5701。

圖5 不同濃度樣品液對羥基自由基清除率的比較Fig.5 Super-oxide anion radical scavenging activities of different purple corn kernel extract

2.6 紫玉米抗氧化作用與花青素和多酚含量的相關性分析

由表1可以看出，紫玉米籽粒花青素粗提液中花青素的含量與總酚含量呈極顯著正相關，相關系數達0.993。花青素和總酚含量與紫玉米的還原力及清除自由基能力呈極顯著正相關，而紫玉米還原力與清除羥基自由基和超氧陰離子自由基能力之間也存在極顯著的相關性，表明用這三項抗氧化指標來評價紫玉米的抗氧化性結果是一致的。

表1 紫玉米籽粒花青素素粗提液的抗氧化作用與花青素和多酚含量的相關性分析Table 1 Correlation of antioxidant activity with anthocyanins and total phenolics of anthocyanin crude extracted of purple corn kernel

3 結論與討論

自由基具有高度的生理活性，是人體生命活動中各種生化反應的中間代謝產物。人體內自由基過多就會導致膜質過氧化和細胞損傷，引起人體衰老、動脈粥樣硬化、癌癥等嚴重疾病。因此日常飲食中攝入一些抗氧化劑或自由基清除劑維持體內自由基代謝平衡是十分重要的[9]。徐亞明等[10]研究發現紫玉米花青素具有一定的還原能力，對超氧陰離子自由基有較好的清除能力，在實驗濃度范圍內，其最大清除率為77.45%。與本研究結果一致，這充分說明具有較好的抗氧化能力，從而為紫玉米花青素的進一步推廣應用提供了依據[10]。本實驗中6種紫玉米籽粒粗提物的還原力及清除超氧陰離子自由基及羥基自由基能力的強弱并不完全一致，可能是花青素對鐵離子的螯合能力不同導致的，對于還原力的測定和清除羥基自由基的測定中均含有鐵離子，這與Ilhami Gulcin等[1]的研究結果一致。此外，花色苷種類和含量差異也可能是不同紫玉米籽粒花青素粗提物之間抗氧化活性存在差異的原因。花青素粗提液中的有效成分不止一種，包括多種花色苷元、類黃酮及多酚物質，從而使得6種不同基因型紫玉米花青素粗提液還原力、清除超氧陰離子自由基及羥基自由基的強弱順序有差異。

本實驗研究結果表明，6種紫玉米花青素具有一定的還原能力及清除超氧陰離子自由基及羥基自由基的能力，說明紫玉米籽粒具有一定的抗氧化生理功能，為紫玉米花青素的推廣應用提供了依據。不同紫玉米品種粗提液中花青素、總酚含量、還原力及清除羥基自由基和超氧陰離子自由基能力的變幅和變異系數較大，表明存在顯著的基因型差異。但是不同紫玉米品種籽粒的花青素和總酚含量與其還原力、清除羥基自由基及超氧陰離子自由基能力呈顯著正相關。花青素和總酚的含量可以作為評價其抗氧化活性的指標。在生產和應用中可以增加紫玉米花青素的濃度和純度來提高抗氧化能力。紫玉米除籽粒富含花青素外，有些紫玉米品種的苞葉、穗軸、莖稈等器官也富含花青素，是紫玉米花青素提取的重要原料，可以利用紫玉米生產中的副產物來開發天然抗氧化劑。

[1]Ilhami G，Dali B，Akcahan G.Antiradical and antioxidant activity of total anthocyanins from perilla pankinensis decne[J]. Journal of Ethnopharmacology，2005（101）：287-293.

[2]趙曉燕，馬越.番茄紅素的溶劑殘留去除及其延緩衰老作用的研究[J]. 華北農學報，2005，20（6）：107-108.

[3]姜平平，呂曉玲，姚秀玲，等.紫心甘薯花色苷抗氧化活性體外實驗研究[J]. 中國食品添加劑，2002（6）：8-10.

[4]徐金瑞，張名位，劉興華.黑大豆種皮花色苷的提取及其抗氧化作用研究[J]. 農業工程學報，2005，21（8）：161-164.

[5]周波，王曉紅，郭連營，等.玉米紫色植株花色苷色素抗脂質過氧化作用[J].中國公共衛生，2008，24（1）：50-51.

[6]朱敏，史振聲，李鳳海，等.正交設計法優化紫玉米穗軸花青素提取工藝[J]. 食品研究與開發，2012，33（2）：122-125.

[7]劉杰超，王思新，焦中高，等.蘋果多酚提取物抗氧化活性的體外實驗[J]. 果樹學報，2005，22（2）：106-110.

[8] 金鳴，蔡亞欣，李金榮，等.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2-Fe2+產生的羥自由基[J]. 生物化學與生物物理進展，1996，23（6）：553-555.

[9]高俊玲，崔建忠，孫樹勛.氧自由基檢測技術的研究進展[J].華北煤炭醫學院學報，1999，1（5）：403-404.

[10]徐亞民，趙曉燕，馬越，等.黑玉米花色苷抗氧化能力的研究[J]. 農業科技與裝備，2008（4）：83-85.

Antioxidant activity of anthocyanin crude extracted of purple corn kernel

ZHU Min，SHI Zhen-sheng，LI Feng-hai
（Shenyang Agricultual University，Shenyang 110866，China）

Anthocyanin crude extracted of different purple corn kernel were studied.The anthocyanin，total phenolic content and antioxidant activity including reducing power， hydroxyl radical and super-oxide anion radical scavenging activities of purple corn kernel anthocyanin extract and the relationship between anthocyanin ，total phenolic content and antioxidant activity were also analyed.The result indicated that there were great differences in anthocyanin，total phenolic，reducing power，hydroxyl radical and super-oxide anion radical scavenging activities among the six purple corn hybrids which FS7011 had the highest anthocyanin ，total phenolic content.The anthocyanin and total phenolic of purple corn anthocyanin had significantly positive correlation with reducing power，hydroxyl radical and super-oxide anion radical scavenging activities.Purple corn grain had high content of anthocyanin and possessed strong antioxidant activity ，which could be used to develop natural antioxidants.

purple corn；total phenolic；anthocyanin；antioxidant activity

TS210.1

A

1002-0306（2014）22-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.011

2014－02－24

朱敏（1982-），女，博士，講師，研究方向：紫玉米遺傳育種及花青素開發利用。

國家自然科學基金（31301258）；遼寧省博士啟動基金（20131101）。