DAD-HPLC法同時測定姜中黃酮類物質

李田葉，翟龍飛，李 巖，郭 露，王向紅，2，*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定 071001；2.河北省農產品加工工程技術研究中心，河北保定 071001）

DAD-HPLC法同時測定姜中黃酮類物質

李田葉1，翟龍飛1，李 巖1，郭 露1，王向紅1，2，*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定 071001；2.河北省農產品加工工程技術研究中心，河北保定 071001）

姜具有豐富的營養價值和藥用保健功效，也是重要的調味料，具有很大的開發前景。應用二極管陣列高效液相色譜法對姜中黃酮類物質進行了分析，色譜條件為：以HYPERSIR C18BDS為固定相，流動相A甲醇，流動相B 0.1%甲酸水為流動相，采用梯度洗脫，流速0.8mL/min，柱溫為30℃，檢測波長270nm和370nm。在0~125mg/L范圍內八種黃酮類物質在線性范圍內均具有良好的線性關系。結果表明，DAO-HPLC法簡便，靈敏，重現性好，可有效的用于姜及姜制品中黃酮類物質含量的測定。

高效液相色譜法，姜，沒食子酸，蘆丁，槲皮素

姜（ginger），古 名 薑 ，別 名 生 姜 、黃 姜 ，為 姜 科（Zingiberaceae）多年生草本植物。姜含有豐富的營養物質，除基本營養成分之外，還含有姜辣素、姜油酮、姜烯酚、姜醇等特殊成分[1-3]，在醫學上又是廣泛應用于臨床的傳統中藥，可治療風寒感冒等病癥，其藥用歷史悠久，還是我國城鄉人民所喜食的重要調味佐料[4-7]，種植范圍廣[1]。但是根據文獻報道，姜的研究主要集中在姜精油、姜辣素的利用[2-3]。

黃酮類化合物具有多種生物活性，除具有抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮靜、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有顯著效果，是一種重要的具有開發前景的天然有機抗氧化劑[8]，在藥 品 及 食品 的 開發 應用中 越 來 越 受到 關 注 。對于黃酮類成分含量的測定方法已經成熟，在植物果實、根、莖葉中都有很多的文獻報道[9-13]，但未看到有關姜中總黃酮以及黃酮類物質的分析，如何對姜的黃酮類物質進行高值化、資源化、生態化利用，以更好的發揮姜的功效，是很有意義和價值的內容。本實驗擬采用二極管陣列高效液相色譜法同時分離八種黃酮類物質，并對姜樣品進行測定，為建立不同種類黃酮類物質同時測定提供高效、快速、靈敏、準確的分析方法，并對姜產品的高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜 保定市南郊果蔬批發市場提供；沒食子酸標準品、兒茶素標準品、木犀草素標準品、蘆丁標準品、楊梅素標準品、異鼠李素標準品、槲皮素標準品、山奈酚標準品 中國藥品檢驗鑒定所提供；甲醇 為色譜純；水 是樂百氏純凈水；其余試劑 均為分析純。

Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司；UV-2800H型紫外可見分光光度計 尤尼科（上海）儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FZG-4A型真空干燥箱 南京天利制藥設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜樣品制備 原料挑選→清洗、切片→60~80℃真空干燥→粉碎→保存。

1.2.1.1 原料挑選 選用新鮮的生姜，避免選擇受到較多機械損傷或其他傷害的原料。

1.2.1.2 清洗、切片 用水清洗干凈雜質，去掉表皮和受到傷害的部位。切片厚度應盡量均勻一致，本實驗采用的是切片厚度為2mm。

1.2.1.3 真空干燥 采用60~80℃的溫度在真空干燥箱干燥，干燥時間以姜片的水分含量不高于12%為依據。

1.2.1.4 粉碎、篩分 粉碎過程中應避免局部高溫而影響制的姜粉的質量。篩分時采用60目篩篩分。

1.2.1.5 保存 室溫放在干燥器中保存備用。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 提取溶劑和提取方法的選擇 本實驗通過對75%甲醇、水、甲醇作為提取溶劑的比較，同時采用加熱回流提取、超聲提取和索氏提取法的比較的提取效果，來確定合適的提取溶劑和提取方法。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 由于關于姜中黃酮類物質的研究內容很少，選取植物中常見的八種黃酮：沒食子酸、兒茶素、木犀草素、蘆丁、楊梅素、異鼠李素、槲皮素、山奈酚進行研究。

因此，精密稱取沒食子酸、兒茶素、木犀草素、蘆丁、楊梅素、異鼠李素、槲皮素、山奈酚的對照品適量溶于色譜醇甲醇制得1.0mg/mL的單標對照品溶液備用。使用時精密吸取單標對照品貯備溶液適量制得混標對照品溶液。

1.2.2.3 樣品溶液的制備 精密稱取姜干燥后姜粉約1.0g，加入40mL甲醇，超聲處理40min，取上清液3500r/min離心5min，將離心后的上清液，移入梨形瓶中，將殘渣重復操作一次，合并離心液旋轉蒸發至干，加入1mL提取溶劑回溶，用有機微孔濾膜（0.45μm）過濾，作為供試品溶液。

1.2.3 色譜條件的確定

1.2.3.1 色 譜 柱 的 選 擇 通 過 比 較 HYPERSIR C18BDS（5μm × 250mm × 4.6mm）、Wondasil C18（5μm × 250mm×4.6mm）、Symmetry C18（5μm×250mm×4.6mm）的分離度、峰對稱性和拖尾因子來衡量兩峰的分離效果，來選擇本實驗所用色譜柱。

1.2.3.2 流動相的選擇 本實驗通過比較甲醇和水組合流動相以及乙腈和水組合流動相的測定結果的分析，同時考慮到經濟成本，選擇合適的流動相。

在確定梯度洗脫的梯度程序時，利用高效液相色譜儀，分別選擇不同的流動相比例來調節梯度，要求保證峰形好且出峰時間較快，使之既能達到基線分離的要求，又有適宜的保留時間。經過對混標以及姜樣品的色譜圖的分析來綜合考慮來確定合適的梯度。

1.2.3.3 流速的確定 本實驗考察了流速對保留時間及分離效果的影響：

經色譜圖分析可知在0.6~1.0mL/min之間，樣品均能達到基線分離。本實驗分別設定采用0.6、0.8、1.0mL/min的流速來比較色譜峰的重疊性，分離度，并要考慮到樣品分析中雜質的干擾，來選擇合適的流速。

1.2.3.4 檢測波長的確定 通過高效液相色譜儀對植物中常見的八種黃酮類物質進行全波長掃描，確定單黃酮的最大吸收波長，綜合光譜分析結果及文獻選擇合適的檢測波長[9-13]。

1.2.4 黃酮類物質線性關系的確定 取上述標準品適量，以色譜醇甲醇分別稀釋成濃度為1、5、10、12.5、25、50、100、125μg/mL的溶液，按上述色譜條件分別取10μL進樣測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，標準品溶液的濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸分析。

1.2.5 精密度實驗 取混標100μg/mL、進樣6次，每次進樣10μL，記錄峰面積，分別計算沒食子酸、兒茶素、木犀草素、蘆丁、楊梅素、異鼠李素、槲皮素、山奈酚的峰面積的RSD。

1.2.6 穩定性實驗 取同一姜樣品溶液，按“1.2.3.3”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣10μL測定，考察其穩定性并記錄峰面積，分別計算沒食子酸、兒茶素、木犀草素、蘆丁、楊梅素、異鼠李素、槲皮素、山奈酚的峰面積的RSD。

1.2.7 加標回收率實驗 稱取已知含量的樣品6份，每份約1g，準確計算樣品中黃酮類物質的含量并分別加入適量的單標對照品溶液，按“1.2.2.3”方法制備供試品溶液，進樣分析。

1.3 數據處理

精密稱取此批次共3份姜粉末各1.0g，分別按“1.2.2.3”方法制備供試品溶液，經過對不同提取溶劑和提取方法的選擇，并在樣品過膜后利用高效液相色譜儀使用測定好的色譜條件來測定樣品含量。

2 結果與分析

2.1 提取條件的最終確定

本實驗比較了75%甲醇、水、甲醇作為提取溶劑的提取效果，通過比較發現由于楊梅素等黃酮類物質在水中的溶解性不高，因此通過高效液相色譜分析發現對姜中所含的黃酮類物質的提取率并不高；用甲醇做提取溶劑發現純甲醇做提取溶劑明顯高于75%的甲醇的提取含量。確定好甲醇作為提取溶劑之后，比較了加熱回流提取、超聲提取和索氏提取法三種方法的提取效果，發現這三種提取方法對姜中黃酮類物質的提取率是加熱回流提取法＜索氏提取法＜超聲提取法，并且超聲提取法的提取率明顯高于其余兩種方法，而且操作簡便省時。最終確定甲醇作為提取溶劑，超聲提取法作為提取方法。

2.2 色譜條件的最終確定

2.2.1 色 譜 柱 的 選 擇 比 較 HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm ×4.6mm）、Wondasil C18（5μm×250mm × 4.6mm）、Symmetry C18（5μm ×250mm ×4.6mm）的 分 離度、峰對稱性和拖尾因子，衡量兩峰的分離效果，通過實驗發現HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm×4.6mm）分 離 效 果 最 好 ，柱 效 最 高 ，故 確 定 HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm×4.6mm）為本實驗的色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇 通過比較甲醇和水組合流動相以及乙腈和水組合流動相的測定結果的分析，發現甲醇和水組合測定時的分離效果更好；在改善峰形，消除拖尾，色譜峰重現性以及對柱子的維護等方面來考慮時，甲酸比磷酸對柱子更加溫和，同時能夠很好的改善峰形，消除拖尾，故加入甲酸，最終確定流動相組合為甲醇和0.1%甲酸水。

2.2.3 流動相梯度的選擇 在確定梯度洗脫的梯度程序時，利用高效液相色譜儀，通過嘗試不同的流動相比例來調梯度，經多次實驗發現表1所示梯度既能保證峰形好且出峰時間較快，使之既能達到基線分離的要求，又有適宜的保留時間，在23min內在色譜圖上就把八種黃酮全部出峰完畢，并且分離的很好。同時樣品也分離的很好，最終確定了合適的梯度。

2.2.4 流速的選擇 分別設定比較0.6、0.8、1.0mL/min的流速，經色譜圖分析可知三種流速相比，0.8mL/min的流速有較好的分離度，同時在樣品分析中雜質干擾較少，故最終確定流速為0.8mL/min。

2.2.5 檢測波長的選擇 根據高效液相色譜儀的檢測器進行的全波長掃描分析可知沒食子酸、兒茶素、楊梅素、蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的最大吸收波長各不相同。其中沒食子酸、兒茶素、楊梅素最大吸收波長大約為270nm，蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的最大吸收波長大約為370nm，由于八種成分的最大吸收波長相差較大，在任意一種檢測波長下均無法得到靈敏度高、譜峰面積較大、分離良好且無干擾的色譜圖。檢測波長越短，基線漂移及干擾越嚴重。檢測波長太大時，也不能準確的定性定量分析，故采用雙波長檢測模式進行檢測。在270nm下，分離沒食子酸、兒茶素、楊梅素；在370nm下分離蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素。色譜圖見圖1、圖2。姜樣品圖見圖3、圖4。

優化后得到的色譜條件為：

色 譜 柱 ：HYPERSIR C18BDS（5μm × 250mm × 4.6mm）；流動相：流動相A 甲醇、流動相B 0.1%甲酸水，流動相梯度見表1；流速：0.8mL/min；檢測波長：270、370nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。分別取對照品溶液和樣品溶液各10μL進行液相色譜儀分析。

圖1 混標標準品270nm波長下色譜圖Fig.1 Under standard 270nm wavelength mixed standard chromatogram

圖2 混標標準品370nm波長下色譜圖Fig.2 Under standard 370nm wavelength mixed standard chromatogram

圖3 姜270nm波長下色譜圖Fig.3 Under standard 270nm wavelength ginger chromatogram

圖4 姜370nm波長下色譜圖Fig.4 Under standard 370nm wavelength ginger chromatogram

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

表2 線性關系及最低檢測限結果（n=6）Table 2 Linear relationship and the result of the minimum detection limit（n=6）

表3 精密度實驗結果（n=6）Table 3 Precision of test results（n=6）

2.3 線性關系考察及最低檢測限的檢出

經過高效液相色譜法分析，對八種黃酮的線性關系和最低檢測限分別進行分析計算，得到結果如表2所示。

通過對表2分析可知，在0~125mg/L范圍內八種黃酮類物質經過線性回歸之后，得出的線性方程中R2均達到0.9990及以上，表明線性良好。并得出八種黃酮類物質的最低檢出限值，表明所建立的色譜方法是可行的，儀器條件良好，測定所得結果可信。

2.4 精密度實驗

通過對8種黃酮類物質的連續5次進樣所得峰面積及保留時間，算出相對標準偏差發現其RSD值較小，表明該方法測定沒食子酸、兒茶素、楊梅素、蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素精密度良好，進一步證明了方法的可行性。

2.5 穩定性實驗和加標回收率實驗

表4 穩定性和加標回收率實驗結果（n=6）Table 4 Stability and sample recovery rate test results（n=6）

結果表明：在穩定性實驗中RSD值較小，表明本實驗測定方法的穩定性良好。同時，本法有較高的加標回收率，同時加標回收率的RSD值較小，故測定結果可靠。

2.6 黃酮類物質含量的測定

最終測定得到姜中楊梅素0.0469mg/g；蘆丁0.0067mg/g；槲皮素0.019mg/g；木犀草素含量0.012mg/g。

3 討論

黃酮的極性因種類不同存在很大的差異，這就為同時快速對樣品中的多種黃酮的定性定量分析提供了很大的難度。

3.1 姜中黃酮的研究現狀

由閱讀大量文獻可知測定除姜中的其他植物中果實、根、莖、葉中的黃酮含量文獻比較多，但是從中文文獻以及外文文獻中已經發表的內容進行分析和整合，只看到有關姜中總黃酮的文獻的報道，但并沒有對姜中具體的單黃酮類物質分析的報道。并且有關其他植物中的關于黃酮類物質的分析最多是同時測定三種黃酮類物質的含量，并且色譜運行時間很長，造成了實驗材料和時間上很大的浪費。本實驗采用的是高效液相色譜法同時對8種常見的黃酮類物質進行分析，簡便快速精確，彌補了在姜中成分的分析的一部分空缺，為以后姜中有效價值的利用率提供了新的思路。

3.2 酸抑制劑的選擇

在實驗中還遇到了一些問題，采用了如下的方法來解決。

由于黃酮類物質中含有酚羥基，因此為了抑制其解離以減少拖峰現象，在流動相中可以考慮加入酸類物質作為酸抑制劑，會使色譜峰尖銳，減少拖尾，分析時間縮短，常用的酸是磷酸和甲酸。本實驗通過比較磷酸和甲酸在起到改善峰形，消除拖尾以及色譜峰重現性以及對色譜柱的維護等方面來考慮，來確定選擇使用磷酸還是甲酸。

3.3 DAD檢測器的優越性

DAD檢測器與VWD檢測器相比，其優勢在于可以同時做多波段的掃描。根據黃酮類物質含量的測定的相關文獻可知，沒食子酸、兒茶素、楊梅素、蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、異鼠李素的最大吸收波長存在差異，因此選擇單波長檢測可能會存在局限，對樣品以及標品含量的測定有不良的影響。

4 結論

本研究通過色譜條件的優化，確定出了最佳的色譜條件為色譜柱：HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm× 4.6mm）；流動相：流動相A 甲醇、流動相B 0.1%甲酸水 ；流 速 ：0.8mL/min；檢 測 波 長 ：270、370nm；柱 溫30℃；進樣量：10μL。利用此色譜條件可以同時對八種常見的黃酮類物質進行定量和定性分析。在使用此色譜方法來測定黃酮類物質，具有簡便、靈敏、重現性好的優點，可有效的用于姜中木犀草素等黃酮類物質含量的測定。同時可以將此色譜分析方法廣泛的運用于其他植物中黃酮類物質含量的定性分析以及定量測定。

通過對提取方法的評價，得出甲醇超聲輔助法是提取姜中黃酮的最佳方法。經過精密度實驗、穩定性實驗、加樣回收率實驗來評價提取方法的可靠性，由數據分析可知用甲醇超聲輔助法是可靠便捷的。

最終測定得到姜中楊梅素0.0469mg/g，蘆丁0.0067mg/g，槲皮素0.019mg/g，木犀草素含量0.012mg/g。

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DAD-HPLC method for simultaneous determination of flavonoids in ginger

LI Tian-ye1，ZHAI Long-fei1，LI Yan1，GUO Lu1，WANG Xiang-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China；2.Hebei Agricultural Products Processing Engineering Technology Research Center，Baoding 071001，China）

Ginger is rich in nutritional value and medicinal health benefits，is also the important spice，had great development prospects.High performance liquid chromatography with diode array detector （HPLC-DAD） was employed to establish the detection method of flavonoids in ginger.Chromatographic conditions were as follows ：as the stationary phase HYPERSIR C18BDS ，mobile phase A methanol， mobile phase B 0.1%formic acid in water as the mobile phase，using gradient elution，flow rate 0.8mL/min at 30℃ ，detection wavelength of 270nm and 370nm.In the 0～125mg/L range eight flavonoids had good linear relationship within the linear range. The method was simple ， sensitive ， reproducibility and could be effectively used for the determination of the content of flavonoids concentrated ginger samples.

HPLC；ginger；gallic acid；rutin；quercetin

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0076-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.008

2014－02－25

李田葉（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏工程。

* 通訊作者：王向紅（1973-），女，博士，教授，研究領域：食品科學。

河北省科技支撐計劃項目（12277117D）。