幾種保存方法對中華哲水蚤和強壯箭蟲體型的影響

馮秋園, 孫曉霞 任琳琳

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東膠州灣海洋生態系統國家野外科學觀測研究站, 山東青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

幾種保存方法對中華哲水蚤和強壯箭蟲體型的影響

馮秋園1,2, 孫曉霞1, 任琳琳1,2

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東膠州灣海洋生態系統國家野外科學觀測研究站, 山東青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

選取 5%的甲醛, –20℃冰凍和液氮為保存方法, 以中國近海的 2種優勢浮游動物中華哲水蚤(Calanus sinicus)和強壯箭蟲(Sagitta crassa)為研究對象, 以體長、體寬和面積為體型參數, 研究了上述幾種保存方法在2個月的時間內對浮游動物體型的影響。研究結果顯示, 對于中華哲水蚤, 甲醛保存2個月后, 體長下降為原始體長的 99.4%, 體寬和面積都增加為 107%; 冰凍和液氮保存 2個月后, 體長分別增加為原始體長的101%和106.8%, 體寬下降為90%和81.6%, 面積下降為92.2%和88.8%。對于強壯箭蟲, 在甲醛、冰凍和液氮 3種保存條件下, 保存 2個月后體長有所下降, 分別為原始體長的92.8%, 50.7%和48.4%。體寬和面積有所增加, 體寬分別變為原始體寬的139.9%, 159.4%和263.8%, 面積分別變為原始面積的119%, 97.8%和107%。綜合分析發現, 膠質類浮游動物在冰凍和液氮保存條件下, 身體變形嚴重, 因此用ZooScan測得的結果誤差較大, 相較而言, 甲醛對膠質類浮游動物體型的影響較小; 中華哲水蚤比強壯箭蟲在各種保存條件下體型的變化要小; 保存初期, 浮游動物體型的變化幅度較大, 后期趨于穩定; 在 3種保存條件下, 中華哲水蚤和強壯箭蟲體長的變化最穩定, 其次是面積。對浮游動物的體型進行研究時, 推薦使用甲醛保存條件下的體長或面積。

膠州灣; 浮游動物; 保存方法; 體型參數

馮秋園(1985-), 女, 山東濟南人, 碩士研究生, 主要從事中國近海浮游動物的研究, E-mail: qyajs@163.com; 孫曉霞, 通信作者, 研究員,博導, E-mail: xsun@qdio.ac.cn

浮游動物是海洋生態系統的主要組成部分, 是聯系作為初級生產者的浮游植物和上層大型游泳動物的樞紐環節。由于浮游動物的個體較小, 種類繁多,很難在船上實現對活體的分類, 計數, 體型測量, 生物量測定等現場實驗, 因此通常先將浮游動物樣品通過一定的方法保存起來。現階段, 5%的甲醛, –20℃冰凍和液氮保存方法都是海洋浮游動物研究常用的保存方法。

浮游動物的生物量是海洋生態學研究的一個重要內容, 是研究海洋生態系統的基本參數[1]。鑒于生物量直接測量的許多局限性[2], 目前國內外常采用體型-生物量的間接估算法[1-9]進行海洋浮游動物生物量的估算。根據已有研究, 不同的保存方法會對浮游動物的體型產生不同程度的影響, 例如, Maria[2]研究了4%甲醛對雙刺紡錘水蚤的成體和幼體體長的影響。Yves等[10]研究了10%甲醛對水母類體型和生物量的影響。由于不同的浮游生物類群, 不同的體型參數, 在不同的保存方式下其變化存在很大的差異,因此研究各種保存方法浮游動物的體型影響, 針對不同的浮游生物類群選取合適的保存方法和體型參數, 對于提高體型-生物量轉換方法的精度非常必要。體長、體寬和面積是浮游動物重要的體型參數,受測量手段的限制, 目前國際上使用較多的是浮游動物體長-生物量方程。隨著圖像等新型觀測手段的發展和應用, 面積等其他體型參數與生物量之間的轉換關系也開始應用[11], 但對于這些參數在不同保存方法下的變化規律研究很少。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和采樣站位

2012年 3月在膠州灣進行采樣, 采樣站位見圖1。使用浮游生物淺水I型網(網口直徑50 cm, 網長145 cm, 網孔500 μm)由底到表垂直拖網采集[12], 采到的鮮活樣品置于冰桶中帶回實驗室處理。

圖1 膠州灣采樣站點Fig.1 Sampling station

1.2 實驗方法

每種保存方法分別設置0、1、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60d共15個時間點,每個時間點設置 a, b兩個平行樣。采集回來的樣品立即進行挑選分類, 挑取完整, 健壯的活的個體, 每個樣本大約15～20個個體。挑選出的樣品用MgSO4溶液進行麻醉[13], 用浮游動物掃描儀(ZooScan, 法國Hydroptic公司)進行掃描, 利用plankton Identifier軟件處理, 得到體長, 體寬等體型數據。將掃描后的樣品全部回收, 分別用5%的甲醛溶液, –20℃冰凍和液氮保存, 在到達設定的時間點以后取出對應的樣品再次進行掃描、計數、測量, 用得到的體長和體寬等體型參數與新鮮樣品掃描得到的體型參數作比,得到體長比、體寬比和面積比等數據, 與保存時間做圖, 分析其變化。

1.3 數據處理

圖2 橈足類和毛顎類浮游動物近似橢球體示例Fig.2 Examples of the best fitting ellipse of Copepods and Chaetognaths

本文采用 ZooScan對浮游動物樣品進行自動掃描, 快速得到浮游動物樣品的分類, 計數, 測量數據。

在處理掃描得到的標準化圖片過程中, 將浮游生物個體近似為長橢球體(圖2), 利用ZooProcess和Plankton Identifer軟件, 分割提取圖片中的連續物體,提取的最小物體的等周長直徑(Equivalent Circular Diameter, ECD)大于0.3mm, 得到體長、體寬和面積等體型參數[11]。

2 結果

2.1 中華哲水蚤在幾種保存條件下的體型變化

圖3 中華哲水蚤在甲醛保存2個月的條件下體長、體寬和面積的變化Fig.3 Changes of length, width and area of Calanus sinicus preserved in 5% formalin

圖4 中華哲水蚤在–20℃保存2個月的條件下體長、體寬和面積的變化Fig.4 Changes of length, width and area of Calanus sinicus preserved in –20℃

圖5 中華哲水蚤在液氮保存2個月的條件下體長、體寬和面積的變化Fig.5 Changes of the length, width and area of Calanus sinicus preserved in liquid nitrogen

中華哲水蚤在 5%甲醛, –20℃冰凍和液氮保存條件下的體型變化如圖3、圖4和圖5所示。體長在甲醛保存下呈現略下降的趨勢, 在冰凍和液氮保存條件下呈現略上升的趨勢, 但在這 3種保存條件下,體長的變化都不大, 幾乎趨于穩定。體寬和面積在甲醛保存條件下略有上升, 保存 2個月后體寬為原始體寬的107.4%, 面積變為原始面積的107.3%; 在冰凍和液氮保存條件下, 體寬和面積有所下降, 保存2個月后, 體寬變為分別變為原始體寬的 91%和81.6%, 面積變為原始面積的92.2%和88.8%。

中華哲水蚤在甲醛、–20℃冰凍和液氮3種保存條件下的體型變化情況見表1。

表1 中華哲水蚤在甲醛、–20℃冰凍和液氮3種保存條件下的體型變化Tab.1 Body size changes of Calanus sinicus preserved in formalin, –20℃ and liquid nitrogen

2.2 強壯箭蟲在幾種保存條件下的體型變化

強壯箭蟲在 5%甲醛, ?20℃冰凍和液氮保存條件下的體型變化如圖6、圖7和圖8所示。在甲醛保存條件下, 體長先下降后趨于穩定, 體寬和面積現先上升后逐漸趨于穩定, 2個月后分別變為原始體型的92.8%, 139.8%和118.5%。在?20℃冰凍保存條件下, 體長先下降后逐漸趨于穩定, 體寬先上升后逐漸趨于穩定, 面積先略上升后下降再趨于穩定, 2個月后分別變為原始體型的50.7%, 160%和97.8%; 液氮保存條件下, 體長先急劇下降后逐漸趨于穩定,體寬呈現出不斷上升的趨勢, 面積先下降后上升再趨于穩定, 保存 2個月后, 各體型分別變為原來的48.8%, 263.7%和107%。

圖6 強壯箭蟲在甲醛保存2個月的條件下體長、體寬和面積的變化Fig.6 Changes of the length, width and area of Sagitta crassa preserved in 5% formalin

圖 7 強壯箭蟲在?20℃保存 2個月的條件下體長、體寬和面積的變化Fig.7 Changes of the length, width and area of Sagitta crassa preserved in–20℃

圖8 強壯箭蟲在液氨保存2個月的條件下體長、體寬和面積的變化Fig.8 Changes of the length, width and area of Sagitta crassa preserved in liquid nitrogen

比較強壯箭蟲在甲醛、?20℃和液氮3種保存條件下的體型變化發現, 體長在 3種保存條件呈現出了先下降后趨于穩定的趨勢, 在–20℃和液氮保存條件下, 體長下降相對劇烈, 分別為原始體長的50.7%和48.8%。體寬在3種保存方法的保存初期都呈現出了一個上升的趨勢, 但是在保存的后期, 體寬呈現出不同的變化趨勢, 在甲醛和冰凍保存條件下, 體寬在最初的增長之后逐漸趨于穩定。在液氮保存條件下, 體寬呈現出一直上升的趨勢, 直到2個月實驗結束的時候還沒有出現穩定的趨勢。面積的變化則相對復雜。綜合分析發現, 體長在保存過程中變化幅度較小, 相對穩定, 其次是面積, 體寬則波動幅度較大, 相對不穩定。甲醛相較于另2種保存方式對強壯箭蟲的體型影響最小。

強壯箭蟲在5%甲醛、–20℃冰凍和液氮3種保存條件下的體型變化情況見表2。

表2 強壯箭蟲在5%甲醛、–20℃冰凍和液氮3種保存條件下的體型變化Tab.2 Body size changes of Sagitta crassa preserved in 5% formalin, ?20℃ and liquid nitrogen

2.3 統計分析

對5%甲醛、–20℃冰凍和液氮 3種保存方法對中華哲水蚤和強壯箭蟲不同體型參數的影響用 spss軟件進行t檢驗, 結果如表3所示。對于中華哲水蚤,甲醛與另 2種保存方法, 冰凍保存和液氮保存相比,對體長的影響存在顯著性差異, 而冰凍保存和液氮保存相比, 對體長的影響無顯著性差異。對于中華哲水蚤的體寬和面積這2個體型參數, 3種保存方法之間不存在顯著性差異。對于強壯箭蟲, 甲醛與另外2種保存方法, 冰凍保存和液氮保存相比, 對體長、體寬和面積這3個體型參數的影響均存在顯著性差異。冰凍保存和液氮保存相比, 對強壯箭蟲的體長和面積的影響不存在顯著性差異, 而對體寬的影響存在顯著性差異。

用 spss軟件對同一種保存方法對中華哲水蚤和強壯箭蟲體型的影響進行t檢驗, 結果如表4所示。對于體長這個體型參數, 3種保存方法對中華哲水蚤和強壯箭蟲的影響均存在顯著性差異, 對于體寬和面積這 2個體型參數, 甲醛保存對中華哲水蚤和強壯箭蟲的影響不存在顯著性差異, 而冰凍保存和液氮保存分別對中華哲水蚤和強壯箭蟲的影響存在顯著性差異。

表3 5%甲醛、–20℃、液氮3種不同保存方法對中華哲水蚤和強壯箭蟲不同體型參數影響的統計分析Tab.3 Biological statistics of changes of different body size parameters of Calanus sinicusand Sagitta crassa preserved in 5% formalin, ?20 ℃ and liquid nitrogen

由上述分析結果可以得出, 不同的保存方法對浮游動物的體型存在不同的影響, 甲醛與冰凍和液氮保存對浮游動物體型的影響差異顯著, 冰凍和液氮保存相比, 對浮游動物體型的影響差異性不顯著,推測甲醛保存是一種化學試劑保存, 與冰凍和液氮保存對浮游動物的作用機理不同, 而冰凍和液氮保存對浮游動物的作用機理相似, 只是由于溫度不同,因此引起的作用程度不同。體長與另外 2種體型參數體寬和面積相比, 在不同的保存條件下變化的差異性更顯著。

而同一種保存方法對甲殼類的中華哲水蚤和膠質類的強壯箭蟲體型的影響存在顯著性差異。相較而言, 甲醛保存較另外2種保存方法, 冰凍和液氮保存對不同種浮游動物體型影響的差異性小, 因此在浮游動物的體型測量實驗中, 相較于冰凍和液氮保存, 推薦使用5%甲醛保存。

表4 同一種保存方法對中華哲水蚤和強壯箭蟲2種不同浮游動物體型參數影響的統計分析Tab.4 Biological statistics of changes of different body size parameters of different zooplankton (Calanus sinicus and Sagitta crassa) preserved in one same preservation

3 討論

對于甲殼類生物中華哲水蚤而言, 各種保存方法對體型變化的影響比較小, 變化相對穩定。甲醛保存下其體長略有下降, 體寬和面積略有上升; 冰凍和液氮保存下體長略有增加, 體寬和面積有所下降,但前者對體型的影響相對較小。比較分析發現, 冰凍和液氮保存條件下中華哲水蚤的體型變化趨勢相同,與甲醛保存下的變化趨勢相反。因此推測, 不論是?20℃的冰凍條件還是–196℃條件下的液氮保存, 其保存過程中導致中華哲水蚤產生生理生化反應的機制可能是相同的, 但兩者在溫度上的巨大差異, 使的作用程度有所不同, 導致體型的變化程度有所不同。已有的報道文獻中, 關于各種保存方法對浮游動物的體型影響的研究并不多。已有的研究表明, 甲醛保存對橈足類浮游動物的體長的影響很小[14-15]。Maria[2]研究了 4%的甲醛溶液對雙刺紡錘水蚤的成體及幼體體長的影響, 研究結果表明鮮活個體和保存后個體其體長無明顯差異, 與本文的研究結果相似。這可能與甲殼類生物體表的幾丁質外骨骼在保存過程中幾乎不受影響或是受到的影響相對較小有關。綜合分析發現甲醛較之于另 2種保存方式對體型的影響較小, 體長和面積在 3種保存方式下變化較小, 幾乎穩定, 因此在利用體型估算中華哲水蚤的生物量時, 推薦使用甲醛保存下的體長和面積。

對于膠質類生物強壯箭蟲而言, 在 3種保存條件下, 體長先下降后趨于穩定。相較而言, 液氮保存對體長的影響大于冰凍大于5%甲醛保存。對于體寬, 3種保存方式都會導致體寬的增加, 體寬增加的幅度,液氮大于?20℃冰凍大于甲醛保存。由于強壯箭蟲屬于膠質類生物, 體內水分含量相對較大, 在保存過程中, 體型柔軟, 變形嚴重, 出現翹尾現象, 冰凍和液氮保存下此現象尤其嚴重, 因此會導致在利用ZooScan測量其體型參數的過程中, 出現較大的誤差; 其次, 在用–20℃冰凍和液氮保存過程中, 要將強壯箭蟲其身體盡量伸展的平鋪于篩絹上, 否則在保存后, 強壯箭蟲的身體會出現不同程度的扭曲,不利于體型測量, 在操作上比較復雜, 不適合大批量樣品的保存, 而 5%的甲醛保存, 操作容易, 而且強壯箭蟲在保存后, 身體較伸展, 堅硬, 不易變形。最后, 從經濟方面考慮, ?20℃冰凍和液氮保存成本遠大于5%甲醛保存。因此基于上面幾個原因, 在對強壯箭蟲的體型進行分析時, 3種保存方法中, 推薦使用5%的甲醛保存。體長、體寬和面積3個體型參數中, 體長和面積在保存過程中變化穩定, 推薦使用。

通過本實驗綜合分析發現, 不同的保存方法對浮游動物的體型的影響不同, 甲醛保存相較于另 2種保存方法對體型的影響更小, 甲殼類的中華哲水蚤比膠質類的強壯箭蟲其體型受保存的影響更小,這與已發表的文章報道相似, 如 Elbert等研究了保存的浮游動物樣品其體積隨時間的變化, 結果表明甲殼類浮游動物占優勢的樣品其體積下降較小, 毛顎類浮游動物在保存過程中有非常明顯的體積損失[16],推測物體內的高含量水分是導致在保存過程中濕重和體積損失較大的原因[11]。不同的體型參數在不同保存條件下的變化也存在差異, 體長與另外 2種體型參數體寬和面積相比, 在不同的保存條件下變化的差異性更顯著。體長和面積 2個體型參數在保存過程中變化相對穩定。同一種保存方法對不同種類的浮游動物體型的影響存在差異。甲醛保存較另外2種保存方法, 冰凍和液氮保存對不同種浮游動物體型影響的差異性小。浮游動物在保存過程中, 保存初期體型變化劇烈, 之后逐漸趨于穩定。

本文采用圖像自動分類識別技術, 分析了 3種不同的保存方式對中華哲水蚤和強壯箭蟲的體長、體寬和面積 3種不同體型參數的影響, 為研究浮游動物的體型-生物量轉換方程提供了校正因子, 并為在大尺度范圍內研究海洋生態系統的物質循環和能量流動等相關問題提供了一定的理論支撐。

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(本文編輯: 梁德海)

The influence of several preservation methods on the body size ofCalanus sinicusandSagitta crassa

FENG Qiu-yuan1,2, SUN Xiao-xia1, REN Lin-lin1,2
(1. Jiaozhou Bay Marine Ecosystem Research Station, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Feb., 13, 2014

Jiaozhou bay; zooplankton; preservation; shape parameter

In this paper,Calanus sinicusandSagitta crassatwo dominant species in coastal waters of China, were used to study the changes of body size (length, width and area) after 2 months preservation using three preservation methods including 5% formaldehyde, -20℃ freeze and liquid nitrogen. The results showed that forC. sinicus, the body length decreased 0.6%, and the body width increased 7% after preserved in formaldehyde for 2 months. The body length ofC. sinicus preserved at -20℃ and in liquid nitrogen increased 1% and 6.8%, and the body width decreased 9% and 18.4% respectively. ForS. crassa, the body length decreased, the body width and the body area increased a bit after preserved for 2 months. The body length decreased 7.2%, 49.3% and 51.6%, and the body width increased 39.9%, 54.4% and 163.8%, and the body area became 119%, 97.8% and 107% of the original ones, respectively after preserved in formaldehyde, -20℃ and liquid nitrogen for 2 months. The gelationous zooplankton became flexible, and deformed seriously when preserved at -20℃ and in liquid nitrogen, so that there were big errors when the body size was measured by zooscan. Comparing to freeze and Liquid nitrogen, formaldehyde led to smaller changes of zooplankton’s body size. The changes of body size ofC.sinicuswere smaller than that ofS. crassaduring the above three preservations. The body size changed dramatically at first, and then tended to stabilize. The body length changes ofC. sinicusandS. crassapreserved in the above three ways were the smallest, followed by the area changes. Body length and area of zooplankton preserved in formaldehyde were recommended when the zooplankton body size were used after preservation.

Q958.8

A

1000-3096(2014)04-0020-07

10.11759/hykx20121212002

2014-02-13;

2014-06-15

國家重點基礎研究發展計劃項目(2014CB441504); 中國科學院戰略性先導科技專項(XDA05030401); 國家海洋公益性行業科研專項(201005014)