合浦珠母貝iPS細胞相關的轉錄因子的克隆及分析

張若云, 徐廣銳, 潘 聰, 謝莉萍, 王洪鐘, 張貴友, 張榮慶

(清華大學 生命科學學院, 北京 100084)

合浦珠母貝iPS細胞相關的轉錄因子的克隆及分析

張若云, 徐廣銳, 潘 聰, 謝莉萍, 王洪鐘, 張貴友, 張榮慶

(清華大學 生命科學學院, 北京 100084)

轉錄因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS細胞研究中具有重要作用, 將它們加入體外培養的細胞中, 可以誘導體細胞去分化成為多能干細胞。作者通過 RACE-PCR技術從合浦珠母貝(Pinctada fucata)的外套膜組織中克隆獲得了3個轉錄因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全長1585bp,開放閱讀框的長度為1131bp, 編碼376個氨基酸, 蛋白結構分析表明它具有保守的HLH和Myc-N結構域。Sox2全長 1908bp, 開放閱讀框長度為 990bp, 編碼329個氨基酸, 蛋白結構分析它具有保守的HMG-box和Soxp結構域。KLF4全長2268bp, 開放閱讀框長624bp, 編碼207個氨基酸, 預測該蛋白具有兩個zf-H2C2_2結構域。BLAST分析它們均與太平洋牡蠣的相關蛋白具有較高同源性, 說明其與太平洋牡蠣親緣關系更近。RT-PCR實驗發現這3個基因在合浦珠母貝外套膜、足、生殖腺、內臟團、閉殼肌和鰓 6種組織中均有表達, 表明它們是非常保守的轉錄因子。本研究對于合浦珠母貝細胞系建立和研究具有啟發意義。

誘導多功能干細胞; 轉錄因子; 克隆; 合浦珠母貝(Pinctada fucata)

胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)具有高度的分化潛能, 可以分化為機體所有類型的細胞,在細胞治療、組織器官移植等臨床醫學領域具有廣泛的潛在用途[1]。誘導的多功能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)具有與ESC相似的高度分化潛能, 由于它是由成體細胞誘導轉化而來, 因此,不僅規避了使用人類胚胎的倫理爭議, 也可以使用病人自體細胞, 設計更加個性化的治療方案。

自從日本學者 Yamanaka領導的課題組先后將4個轉錄因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4導入體外培養的小鼠和人的成纖維細胞, 使其去分化, 并轉化為iPS 細胞[1-2]后, iPS細胞在全球范圍內得到廣泛應用。

由于這些轉錄因子參與維持干細胞的多能性和自我更新的能力, 故而又被稱作多能性因子(Pluripotency factors)。多能性因子通常具有3個特點: (1)通常在胚胎發育早期表達量較高, 而在大多數已分化的組織中表達降低; (2)維持干細胞的多能性, 其表達量過高或過低均會引起胚胎干細胞分化; (3)多能性因子可協同作用[3]。

這4種多能因子在iPS細胞中起著至關重要但各不相同的作用。

Oct4在干細胞、早期胚胎細胞和生殖細胞中特異表達, 且主要通過與其他重要的轉錄因子, 如Sox2和Nanog等, 協同作用調節胚胎干細胞的多能性[4-5]。c-Myc基因的表達與細胞的增殖分化有關, 例如,c-Myc基因的表達量增強可以促進細胞生長惡變,導致腫瘤發生, 而在細胞分化的過程中,c-Myc基因的表達量則會降低[5-6]。Sox2基因在胚胎早期發育中發揮重要作用, 可以作為多能性細胞譜系的一個標志物[5]。在體外,Sox2在未分化的胚胎干細胞(ES cell)、胚胎癌細胞(EC cell)中表達, 且隨著細胞的分化, 其表達量降低[7-9]。KLF4同樣也在細胞增殖和分化過程中發揮重要作用, 可以通過作用于靶基因p21異位表達, 從而抑制細胞的生長和增殖, 也可在p21缺失的細胞中, 通過下調p53來促進細胞增殖[4]。

本實驗室之前的研究證明合浦珠母貝外套膜組織在體外培養時功能與體內外套膜細胞類似, 由此為在細胞水平上研究珍珠質生物礦化提供了新方法[10]。但是合浦珠母貝外套膜細胞體外增殖和傳代培養一直是體外細胞系建立與培養的難題[11-13]。此次克隆得到合浦珠母貝中的轉錄能因子Sox2、KLF4及c-Myc基因,一方面為合浦珠母貝中 iPS細胞研究奠定基石; 另一方面考慮到這幾個轉錄因子在細胞增殖和分化過程中所起的重要作用, 或許也可以為合浦珠母貝建立細胞系提供支持, 為生物礦化研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

合浦珠母貝(Pinctada fucata)采自廣西北海市珍珠總公司珍珠養殖場。5′/3′RACE Kit(Clotech公司),EasyPureQuick Gel Extraction Kit(TransGen公司), dNTPs、Reverse Transcriptase M-mLV、各種酶(TaKaRa公司), Trizol 試劑(Invitrogen), DEPC(上海生工), 及IPTG、X-gal(Sigma); 其他試劑為國產分析純, 各種引物由上海生工合成, DNA測序由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據本實驗室構建的合浦珠母貝外套膜轉錄組文庫中c-Myc、Sox2及KLF4基因的同源序列片段設計5′RACE和3′RACE引物, 基因克隆所用引物序列見表1。

表1 c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA克隆所需引物Tab.1 The primers for cloning cDNA of c-Myc, Sox2 and KLF4 from Pinctada fucata

在得到c-Myc、Sox2及KLF4基因5′和3′端序列的基礎上設計Full1和Full2兩端引物。

RT-PCR所需引物見表2。

1.2.2 總RNA提取

取合浦珠母貝的外套膜組織, 用液氮迅速冷凍后磨碎, 加適量Trizol 試劑(50～100 mg/mL )。總RNA提取步驟如下: 樣本中加入200 μL氯仿, 混勻后室溫放置3 min, 離心15 min取上清; 重復上述步驟一次;上清加入 500 μL 異丙醇, 混勻靜置 10 min, 離心15 min棄上清; 加入 1mL 75%乙醇, 振蕩混勻離心5 min; 沉淀室溫晾干, 加入40 μL DEPC水溶解, –80℃保存。通過A260/280檢驗獲得的RNA的完整性和濃度。

表2 RT-PCR和Real-Time PCR所需引物Tab.2 The primers for RT-PCR and Real-Time PCR

1.2.3 基因的克隆

5′RACE和 3′RACE按照 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒進行: 首先以合浦珠母貝外套膜的總 RNA為模板, 合成 5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE- Ready cDNA。然后分別以這兩個 cDNA序列為模板, 進行 5′RACE和3′RACE。PCR反應程序參照試劑盒說明書。

根據得到的 5′端和 3′端的兩段序列進行全長基因的PCR驗證。PCR反應程序: 94℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸3 min, 30個循環; 72℃延伸10 min。

PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳, 切下目的條帶, 回收PCR產物。將回收產物與T/A克隆載體pGEM-T easy vector (Promega)連接, 轉化大腸桿菌Trans2-Blue Chemically Competent Cell (TransGen)菌株, 通過菌落PCR選取陽性克隆送公司測序。

1.2.4 基因的序列分析

應用ORF Finder查找開放閱讀框; 用ProtParam (http: //web.expasy.org/protparam/)預測編碼蛋白的分子量和等電點; 應用 SignalP(http: //www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預測信號肽; 并且使用 Pfam(http:// pfam.sanger.ac.uk/search/sequence)預測蛋白保守結構域。應用blast在線工具(http: //web.expasy.org/blast/)比對核苷酸和氨基酸序列的同源性, 使用 MEGA4軟件繪制系統進化樹。

1.2.5 基因的組織分布

首先采用 TaKaRa公司的 PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒, 按照說明書條件操作, 將合浦珠母貝外套膜、足、生殖腺、內臟團、閉殼肌和鰓6種組織總RNA反轉錄合成cDNA模板。然后通過RT-PCR鑒定目的基因在各組織分布情況。

2 結果與分析

2.1 c-Myc、Sox2及KLF4基因的克隆及其序列分析

通過RACE方法克隆獲得c-Myc、Sox2及KLF4基因的全長cDNA, genbank登錄號分別為KC758857、KC758858和KC758859。

基因c-Myc、Sox2及KLF4的全長cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列、相對分子質量、等電點等信息如表3及圖1～圖3所示。

2.2 編碼蛋白的結構預測分析

表3 c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA序列及其編碼的蛋白性質Tab.3 Sequences and proteins of c-Myc, Sox2 and KLF4 from Pinctada fucata

圖1 c-Myc基因全長cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列Fig.1 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of c-Myc gene from Pinctada fucata

通過SignalP、Pfam和SOPMA在線分析得到以下結果。

c-Myc蛋白沒有信號肽, 不存在跨膜區。Pfam軟件預測該編碼蛋白含有一段保守的 HLH(helixloop-lelix domain)結構域, 及 Myc-N 保守區域, 而myc蛋白家族是典型的HLH亮氨酸拉鏈型轉錄因子,可以通過與DNA特異位點結合而對轉錄過程進行調控, 從而調控細胞的增殖和分化。據此分析, 該編碼蛋白預測正確并參與轉錄調控[14-15]。

Sox2蛋白未預測到信號肽, Pfam 預測含有HMG-box(high mobility group box), 它是Sox蛋白的特征保守結構域, 這種高遷移率基團在需要染色質構象發生改變的 DNA相關調控過程中發揮作用,如復制轉錄和DNA修復等[10,13]。編碼蛋白上還含有一段與DNA轉錄調控有關的Soxp(Sox transcription factor)結構域[16]。推測該編碼蛋白參與DNA轉錄調控。

圖2 Sox2基因全長cDNA序列及編碼氨基酸序列Fig.2 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of Sox2 gene from Pinctada fucata

KLF4蛋白未預測到信號肽, Pfam預測含有兩個zf-H2C2_2(Zinc-finger double domain )結構域, 這是KLF蛋白的特征結構域, 表明編碼蛋白與基因的表達調控相關[17-18]。

2.3 c-Myc、Sox2及 KLF4蛋白的同源性分析

利用BLAST軟件分析c-Myc、Sox2及KLF4基因編碼蛋白的同源性, 并使用 MEGA4軟件繪制系統進化樹(圖4)。

同源性分析結果顯示: (1)c-Myc基因編碼蛋白與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)的Myc蛋白同源性最高, 約為 63%。同時, 編碼蛋白與弗羅里達文昌魚(Branchiostoma floridae)、青島文昌魚(Branchiostomabelcheri)以及半索動物長吻蟲(Saccoglossus kowalevskii)的Myc蛋白也分別有約45%、45%和47%的相似性。(2)在分類學上, 合浦珠母貝與太平洋牡蠣同為軟體動物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia), 文昌魚與長吻蟲同屬脊索動物門(Chordata)。在c-Myc基因的保守性上, 合浦珠母貝與太平洋牡蠣保同源性更高,而與文昌魚和柱頭蟲的同源性較低。(3)Sox2基因編碼蛋白與太平洋牡蠣(C. gigas) 、池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii) 的 Sox2蛋白以及歐洲冒貝(Patella vulgata) 的uSoxB蛋白分別有約67%、68%和72%的相似性。池蝶蚌也屬雙殼綱, 冒貝屬腹足綱(Gastropoda)。這3種生物與合浦珠母貝親緣關系都比較近,同源性比對結果也相近。(4)KLF4基因編碼蛋白與紫色球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)的 KLF4蛋白、長吻蟲(S. kowalevskii)的類KLF2轉錄因子和擬正海膽(Paracentrotus lividus)的KLF2/4蛋白分別有約 96%、96%和 95%的相似性, 另外與太平洋牡蠣C. gigas的KLF1蛋白同源性約為67%。(5)擬正海膽屬棘皮動物門(Echinodermata), 編碼KLF4蛋白與海膽中同一亞型蛋白同源性更高, 96%的同源性表明KLF4基因在不同物種中具有高度的保守型。與牡蠣中KLF1蛋白的同源性較低, 可能是由于這兩個蛋白亞型自身的差異所致。(6)同源性比對結果顯示合浦珠母貝中的這 3個基因與太平洋牡蠣同源性最高,事實上牡蠣與珍珠貝同是雙殼貝類, 親緣關系本來就相近, 這里也得到證明。(7)而 3個基因的同源性比對數據顯示, KLF4蛋白在不同物種中的同源性最高, 表明KLF4基因在不同物種中更為保守,Sox2的保守性次之,c-Myc基因相對最不保守。

圖3 KLF4基因全長cDNA序列及編碼氨基酸序列Fig.3 The complete cDNA sequence and deduced amino acids of KLF4 gene from Pinctada fucata

圖4 c-Myc(a)、Sox2(b)和KLF4(c)基因系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of c-Myc (a), Sox2 (b) and KLF4 (c) gene

2.4 c-Myc、Sox2及KLF4在合浦珠母貝各組織中分布

與預期相符,c-Myc、Sox2和KLF4是3個非常保守的轉錄因子, 它們在合浦珠母貝的外套膜、足、生殖腺、內臟團、閉殼肌和鰓各組織中都有分布。

圖5 Sox2、c-Myc和KLF4基因在合浦珠母貝各組織分布Fig.5 Disstribution of Sox2, c-Myc and KLF4 genes in tissues of Pinctada fucata

3 討論與小結

自2006年Yamanaka[1]研究小組利用轉錄因子在體外將小鼠體細胞成功誘導成為多能干細胞之后,Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4作為多能因子被深入和廣泛的研究。作者在合浦珠母貝外套膜轉錄組中找到c-Myc、Sox2及KLF4基因的片段, 并通過RACE-PCR技術克隆得到它們的全長序列, 不僅為以后研究合浦珠母貝中 ips 細胞奠定基礎, 或許還可為生物礦化的研究提供新的切入點。

生物信息學分析預測到 c-Myc編碼蛋白的一段HLH功能域, 以及 Myc-N保守性片段, 這些都是c-Myc基因編碼蛋白的典型特征, 可以通過與 DNA特異位點結合而對轉錄過程進行調控, 從而起到調控細胞增殖和分化的功能。此前已有較多文章報道過c-Myc蛋白在轉錄調控中所起的重要作用[14-15]。

而Sox2基因編碼蛋白結構中預測到 HMG-box和Soxp結構域, 正如前文所述, HMG-box存在于高遷移率的基團中, 因為這種特性參與到需要改變染色質構象的一系列DNA相關調控過程中[13]。而Soxp結構域作為轉錄因子參與DNA轉錄調控[16], 說明合浦珠母貝中Sox2編碼蛋白也極有可能參與DNA轉錄調控過程中。

KLF4編碼蛋白中含有兩個與基因表達調控有關的鋅指雙域。因此, 這3個轉錄因子在合浦珠母貝中同樣在DNA水平起著調控基因表達的作用, 對它們的研究具有重要的意義。

在于其他已知基因的同源性比對中, 作者發現在與合浦珠母貝相近的物種尤其是牡蠣中都找到與這 3種基因編碼的氨基酸殘基序列具有較高相似性的蛋白, 表明它們在遺傳進化上具有更近的關系。而合浦珠母貝中預測的這3種蛋白都在N端序列與其他已知蛋白有較大差異, 因此根據這一點可以猜想它們功能上的差異, 可以有針對性的進一步研究。而諸如牡蠣等其他生物中相關蛋白的研究[19-21]也可為合浦珠母貝中這幾個轉錄因子的研究提供重要參考價值。

[1] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic andadult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell, 2006, 126(4): 663-676.

[2] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J]. Cell, 2007, 131 (5): 861-872.

[3] 胡雨, 姚紀花. 斑馬魚多能性因子的研究進展[J]. 遺傳, 2012, 34(9): 1097-1107.

[4] Pan G J, Chang Z Y, Sch?ler H R, et al. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4[J]. Cell Res, 2002, 12(5-6): 321-329.

[5] 張琦, 姚思國, 陳建泉, 等. 轉錄因子與誘導性多能干細胞[J].生命科學, 2009, 21(2): 299-302.

[6] Adhikary S, Eilers M. Transcriptional regulation and transformation by Myc proteins[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6(8): 635-45.

[7] 陳艷玫, 姚鑫. 轉錄因子 Sox2 的研究進展[J]. 生命科學, 2004, 16(3): 129-134.

[8] Cauffman G. Van de Velde H, Liebaers I, et al. Oct-4 mRNA and protein expression during human preimplantation development[J]. Mol Hum Reprod, 2005, 11(3): 173-181.

[9] Fong H, Hohenstein K A, Donovan P J. Regulation of self-renewal and pluripotency by Sox2in human embryonic stem cells[J]. Stem Cells, 2008, 26(8): 1931–1938.

[10] Gong N P, Ma Z J, Li Q, et al. Characterization of calcium deposition and shell matrix protein secretion in primary mantle tissue culture from the marine pearl OysterPinctada fucata[J]. Mar Biotechnol, 2008, 10: 457-465.

[11] Gong N P, Li Q, Huang J, et al. Culture of outer epitheli al cells from mantle tissue to study shell matrix protein secretion for biominera lization[J]. Cell Tissue Res, 2008, 333: 493-501.

[12] Mount A S, Wheeler A P, Paradkar R P, et al. Hemocyte-MediatedShell mineralization in the EasternOyster[J]. Science, 2004, 304: 297-300.

[13] Thomas J O. HMG1 and 2: architectural DNA-binding proteins[J]. Biochem Soc Trans, 2001, 29 (Pt 4): 395-401.

[14] Prochownik, E V. c-Myc: Linking transformation and genomic instability[J]. Current Molecular Medicine, 2008, 8(6): 446-458.

[15] Blackwell T K, Kretzner L, Blackwood E M, et al. Sequence-specific DNA-binding by the c-Myc protein. Science, 1990, 250(4987): 1149-1151.

[16] Tanaka S, Kamachi Y, Tanouchi A, et al. Interplay of SOX and POU factors in regulation of the Nestin gene in neural primordial cells[J]. Mol Cell Biol, 2004, 24: 8834-8846.

[17] Arnold K, Bordoli L, Kopp J, et al. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein struct-ure homology modelling[J]. Bioinformatics, 2006, 22(2) : 195-201.

[18] Kiefer F, Arnold K, Künzli M, et al. The SWISS-MODEL Repository and associated resources[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 37(Database issue) : 387-392.

[19] Zhang G F, Fang X D, Guo X M, et al. The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation[J]. Nature, 2012, 490(7418): 49-54.

[20] Putnam N H, Butts T, Ferrier D E K, et al. The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotype[J]. Nature , 2008, 453 (7198): 1064-1071.

[21] Freeman R M, Wu M, Cordonnier-Pratt M M, et al. cDNA sequences for transcription factors and signaling proteins of the hemichordate Saccoglossus kowalevskii: efficacy of the expressed sequence tag (EST) approach for evolutionary and developmental studies of a new organism[J]. Biol Bull, 2008, 214 (3): 284-302.

(本文編輯: 梁德海)

Cloning and sequence analysis of iPS related transcription factors fromPinctada fucata

ZHANG Ruo-yun, XU Guang-rui, PAN Cong, XIE Li-ping, WANG Hong-zhong, ZHANG Gui-you, ZHANG Rong-qing
(School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

Jan., 22, 2014

ips cells; transcription factors; cloning;Pinctada fucata

The four transcription factors namedSox2,Oct4,c-MycandKLF4can reprogram differentiated in vitro culture cells to an embryonic-like state, in another name, ips cells. The complete gene sequence ofc-Myc,Sox2andKLF4fromPinctada fucatawas amplified by RACE PCR. The complete sequence ofc-Mycgene was 1585 bp and the complete ORF length was 1131 bp which encoded a protein with 376 amino acid residues. The analysis of protein structure showed c-Myc protein had the conservative HLH and Myc-N domains, which have the DNA-binding function.Sox2gene has the complete sequence of 1908 bp and the complete ORF length of 990 bp which encoded a protein with 329 amino acid residues. And the Sox2 protein had the conservative HMG-box and Soxp domains, which have the DNA-regulation function.KLF4gene was 2268 bp long and the complete ORF length was 624 bp which encoded a protein with 207 amino acid residues. And the KLF4 protein had two zf-H2C2_2 domains, which have the DNA-binding function. Blast analysis indicated the three deduced amino acid sequences of the c-Myc, Sox2 and KLF4 genes fromP. fucatashowed high homology with proteins fromCrassostrea gigas. RT-PCR result shows that these three genes were expressed in all six tissues fromP. fucataincluding mantle, foot, gonal, visceral mass, adductor muscle and gill, suggesting that these genes were conservative transcriptional factors. Our study inspires the work on cell culture and research inP. fucata.

S823.3

A

1000-3096(2014)04-0007-08

10.11759/hykx20130922001

2014-01-22;

2014-05-12

國家重點基礎研究發展計劃項目(2010CB126405)

張若云(1987-), 女, 江蘇徐州人, 碩士, 主要從事生物礦化研究, E-mail: zhangry61@ 126.com