CD44在不同腫瘤細胞表面陽性表達率的實驗研究

王 玨，沈 雁，張俊玲，涂家生

（1.中國藥科大學藥學院藥劑學教研室，江蘇南京210009；2.江蘇省蘇北人民醫院腫瘤科，江蘇揚州225001）

·實驗研究·

CD44在不同腫瘤細胞表面陽性表達率的實驗研究

王 玨1，沈 雁1，張俊玲2，涂家生1

（1.中國藥科大學藥學院藥劑學教研室，江蘇南京210009；2.江蘇省蘇北人民醫院腫瘤科，江蘇揚州225001）

目的檢測CD44在腫瘤細胞表面的陽性表達率，為以CD44為靶點的腫瘤靶向治療提供新的理論依據。方法 采用流式細胞術檢測HCT116人結腸癌細胞，SGC－7901、MGC－803胃癌細胞，A549人肺腺癌細胞，HepG2人肝癌細胞，CNE－2人鼻咽癌細胞，U87MG惡性膠質瘤等腫瘤細胞表面CD44表達情況。結果各腫瘤細胞表面均表達CD44。其中胃癌SGC－7901、MGC－803、肝癌HepG2、鼻咽癌CNE－2細胞表面CD44細胞的陽性率分別為17.90%±1.67%、18.36%±9.27%、24.61%±4.0%和19.03%±1.52%，呈高表達狀態。結論SGC－7901、MGC－803、HepG2、CNE－2細胞與HCT116、A549和U87MG細胞表面CD44陽性表達率相比有顯著性差異（P＜0.05）。

CD44；腫瘤靶向；流式細胞術；陽性表達率

侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要生物學特征，是導致手術、放療、化療等手段失敗和患者死亡的最主要原因，其中細胞黏附分子參與整個過程并起重要作用［1］。CD44是一種細胞表面黏附分子，在淋巴細胞、成纖維細胞和增生的上皮細胞中都可檢測到其存在。近年來發現，CD44分子與許多惡性瘤的侵襲和轉移有著密切的聯系，在這些惡性瘤細胞表面，CD44分子都有異常表達［2，3］。

本文將測定幾種常見腫瘤細胞表面的CD44表達情況，為開發CD44介導的腫瘤靶向給藥系統奠定基礎。

1 材料和試劑

HCT116，SGC－7901，MGC－803，A549，HepG2，CNE－2，U87MG細胞株均由中國藥科大學藥理教研室提供；RPMI1640培養液、DMEM培養液均購自Gibco公司；FITC標記的鼠抗人CD44單克隆抗體，FITC標記的鼠抗人CD44同型對照抗體均購自Sigma公司；二氧化碳培養箱（美國Thermo Scientific公司）；Facscal流式細胞儀（美國BectonDickinson公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 人結腸癌HCT116和腦膠質瘤U87MG細胞用含有10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和100μg·mL－1鏈霉素的DMEM／F12培養液常規培養，人胃癌SGC－7901、MGC－803細胞和人非小細胞肺癌A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養基常規培養，人肝癌HepG2細胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養，人鼻咽癌CNE－2用內含10%新生牛血清、200 U·mL－1青霉素、200μg·mL－1鏈霉素的RPMI－1640培養。培養條件均為5%CO2、37℃、飽和濕度。所有實驗細胞均取自對數生長期。

2.2 流式細胞術鑒定細胞表面CD44的表達0.25%胰酶分別消化處于對數生長期的HCT116、SGC－7901、MGC－803、A549、HepG2、CNE－2、U87MG細胞，顯微鏡下觀察。細胞呈單細胞懸液時用含血清的培養液終止消化，200×g離心5 min，棄上清，再用適量PBS洗滌3遍計數，所有細胞均按每管約106個細胞的比例，收集至2個Eppendorf管中。各腫瘤細胞實驗組加入適量鼠抗人CD44單克隆抗體，對照組加入等體積CD44同型對照抗體，室溫避光放置15～30 min，PBS洗滌2遍，500μL PBS重懸，移至流式管中上機檢測，收集104個細胞，熒光強度以對數放大，結果用CD44細胞的陽性率表示，數據用軟件進行分析。

2.3 統計學方法 采用Sigmaplot軟件對數據進行統計分析，結果用±SD表示，采用單因素方差分析（One－way，ANOVA）進行各組間均數比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

如圖1－7所示，各腫瘤細胞表面均表達CD44。其中SGC－7901、MGC－803、HepG2、CNE－2細胞表面CD44細胞的陽性率分別為17.90%±1.67%、18.36%±9.27%、24.61%±4.0%和19.03%±1.52%，呈高表達狀態（圖8）。與HCT116，A549和U87MG細胞表面CD44陽性表達率相比有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 HCT116細胞CD44陽性表達率分布圖

4 討論

最新研究發現，CD44還被廣泛作為乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌和結腸直腸癌等多種腫瘤干細胞的一個重要表面標記分子。另有研究發現，CD44似乎對所有類型的癌癥具有顯著的調節作用，更闡明這個標記可能有助于評估其預后的重要性［4］。

另外，在藥學研究領域，CD44作為腫瘤靶向給藥系統的靶點已被眾多研究者所關注，其特異性受體透明質酸（HA）作為主動靶向基團被引入各類給藥系統，如以脂質體為基礎的納米載體［5］、陽離子聚合物基因載體［6］、自組裝納米粒［7］等，尤其隨著近年來對腫瘤干細胞的研究逐漸深入，以CD44為代表的各類細胞表面黏附分子被用于多種腫瘤干細胞的分離、鑒定和純化。因此，研究并探索CD44在各種細胞系中陽性表達率的高低可使腫瘤靶向給藥系統的設計更加具有針對性。

經研究發現在實體腫瘤邊緣組織富集透明質酸，同時腫瘤細胞表面則高度表達透明質酸受體－CD44

［8，9］。這提示透明質酸經過受體介導信號傳導途徑對腫瘤的生長、黏附、轉移起著重要的作用。在惡性腫瘤細胞表面的CD44受體對透明質酸具有很高的親和力，能將其結合后介導胞吞作用將其內吞，從而達到向腫瘤外周組織侵犯及遠處轉移的目的。CD44受體也表達于正常組織原代細胞中，但正常組織原代細胞的CD44受體大部分處于一種非活化的沉默狀態，其對透明質酸的親和力遠低于腫瘤細胞［10，11］。實體腫瘤與透明質酸的這種關系，正好為化療藥物的靶向性輸送提供一種可能的途徑，即通過透明質酸與CD44受體結合介導的胞吞作用將藥物靶向性送入腫瘤細胞內。

圖2 SGC－7901細胞CD44陽性表達率分布圖

圖3 MGC－803細胞CD44陽性表達率分布圖

圖4 A549細胞CD44陽性表達率分布圖

圖5 HepG2細胞CD44陽性表達率分布圖

圖6 CNE－2細胞CD44陽性表達率分布圖

圖7 U87－MG細胞CD44陽性表達率分布圖

文獻報道多數腫瘤細胞CD44表達陽性率在60%以上，有些甚至達到99%。本研究未得出相同結論，這可能跟細胞培養時的傳代次數有關，傳代次數越多，細胞變異和惡化程度越嚴重，CD44的表達會有所改變，但傳代次數太多會導致細胞貼壁效果下降，影響實驗效果。本研究所用腫瘤細胞種類偏少，其他腫瘤細胞類型尚未涉及，有待進一步探索。

綜上所述，CD44在胃癌、肝癌、鼻咽癌中呈相對高表達，在肺癌、結腸癌、腦癌中成相對低表達。這對設計CD44介導的靶向腫瘤給藥系統奠定了研究基礎。

圖8 CD44在腫瘤細胞中的表達（n＝3）

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Analysis on the express of surface adhesion molecule CD44in different tumor cells

WANG Jue1，SHEN Yan1，ZHANG Jun-ling2，TU Jia-sheng1
（1.Department of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Department of Oncology，Subei People′s Hospital of Jiangsu Province，Yangzhou 225001，China）

ObjectiveTo detect the expressions of surface adhesionmolecule CD44in tumor cells in order to provide a new theoretical reference for CD44tumor targeted therapy.M ethodsThe expressions of CD44of HCT116，SGC－7901，MGC－803，A549，HepG2，CNE－2 and U87MG cellswere determined by flow cytometry.ResultsCD44was all expressed on these tumor cells.CD44was over expressed on SGC－7901，MGC－803，HepG2 and CNE－2 and the positive expression rate were 17.90%±1.67%，18.36%±9.27%，24.61%±4.0%and 19.03%±1.52%，respectively.ConclusionThere was significant difference between the positive expression rate of SGC－7901，MGC－803，HepG2，CNE－2 and HCT116，A549，U87MG（P＜0.05）.

CD44；Tumor targeted；Flow cytometry；Positive expression rate

R730.23

A

2095－5375（2014）02－0063－005

中央高校基本科研業務費專項基金資助項目（No.JKPZ2013006）；國家自然科學基金資助項目（No.81072588，81201182）

王玨，女，研究方向：基因給藥載體及遞送系統，E－mail：myxwj2007＠163.com

涂家生，男，教授，研究方向：藥物新劑型與新技術，Tel：13605159819，E－mail：jiashengtu＠cpu.edu.cn