參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠腦細胞凋亡相關蛋白的影響

賈丹兵，劉 珊，李乃民，唐立明，李春杰，于 淼，鞏沅鑫，魏 博

參姜鎖陽益氣片是由西洋參、桂枝、紅花、干姜、鎖陽等組成的中藥制劑，具有溫熱祛寒，通經活絡，益肺補腎，調炅散瘀之功效。該藥物制備工藝穩定［1-2］，質量標準可靠［3］。本研究觀察參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠海馬區和下丘腦細胞凋亡相關蛋白bax、bcl-2和capase-3表達的影響，探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠48只，雄性，體重(200±20)g。由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供［許可證號:SCXK(黑)2008004］。常規條件下適應性飼養1周后開始實驗。

1.2 實驗儀器及藥品

1.2.1 主要儀器:電子天平(上海梅德勒公司)，電熱恒溫箱(上海一恒)，2135型組織切片機(德國徠卡)，醫用微波爐(日本松下)，Moticam 3000顯微攝影成像系統(美國Motic)，Motic Med 6.0病理圖像分析系統(美國Motic)。

1.2.2 主要藥品與試劑:參姜鎖陽益氣片(規格:350 mg，由解放軍211醫院提供，批號:20100702)，大株紅景天膠囊(規格:0.38 g，江蘇康緣藥業，批號:081108)，鹽酸腎上腺素(天津金耀批號:1007121)，水合氯醛(天津科密歐)。兔抗bcl-2、bax和caspase-3多克隆抗體(武漢博士德)，PV6001兩步法二抗、DAB顯色劑(北京中杉)，其他為國產分析純產品。

1.3 動物分組與模型制備 隨機選取8只正常大鼠為A組，其余40只大鼠采用腎上腺素加冰水浴復合低溫冷凍法［4］，建立寒凝氣滯血瘀證大鼠動物模型。方法如下:大鼠禁水12 h，第1天，先采用皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.8 ml/kg，共注射2次，間隔4 h，第1次注射給藥后2 h將大鼠置4℃冰水浸泡5 min。于第2天將大鼠分別放入低溫冷柜小鼠籠中，在-20℃的冷環境中持續受凍4 h左右。待大鼠出現寒戰，畏寒喜暖，蜷縮少動，朦朧欲睡，眼中無神，反應遲鈍，呼吸微弱，皮毛蓬松樹立無光澤，小便色淡，大便濕爛，唇周發黑，耳色暗紅，爪尾部紫暗，舌暗紅等癥狀和體征時將大鼠取出冷柜。每日9:00～13:00冷凍1次，連續冷凍7次。將造模成功的40只大鼠隨機分為B、C、D、E、F組，每組8只，各組在末次造模后1 h灌胃給藥，每天1次，連續給藥2周，給藥劑量按成人每日每公斤體重用量進行折算如下:C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg;A、B組均給予等體積生理鹽水。

1.4 bcl-2、bax和capase-3表達檢測

1.4.1 標本采集方法:各組大鼠應用戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至升主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。4℃生理鹽水200 ml快速灌注，之后稍減慢灌注速度沖洗至流出液清亮，斷頭后快速于冰盤上取出全腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定，分別取海馬與下丘腦組織，常規石蠟包埋，切片厚5μm，用于免疫組化染色。

1.4.2 免疫組化PV二步法:切片常規脫蠟到水，3%過氧化氫溶液(H2O2)孵育10 min，PBS沖洗2 min 3次，微波修復:切片入枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6)，微波爐中5 min 2次，間隔10 min。冷卻至室溫，滴加一抗，4℃冰箱中過夜，PBS沖洗2 min 3次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗2 min 3次，DAB顯色5～10 min。蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染1 min，常規脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.3 分析方法:采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統，對免疫組化染色切片進行分析。在400倍鏡下每個切片觀察4個高倍視野，經顯微鏡攝像儀攝入，按512×512像素分布，并保存在病理圖像分析系統內，用免疫組化分析模塊進行分析，先進行分割，選擇點狀分割將陽性物標記為棕黃色，除去非特異染色，計算出陽性細胞表達數目，取其平均值，進行統計學處理。

1.5 統計學方法 應用SPSS 18.0軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 免疫組化 大鼠海馬區和下丘腦神經元細胞的陽性表達在胞質中呈現黃色或棕黃色，顏色由深到淺，以神經元細胞質中表達最明顯，見圖1～6。

2.2 凋亡相關蛋白表達 與A組比較，B組海馬區和下丘腦bcl-2陽性細胞數明顯降低，bax和capase-3陽性細胞數明顯增加(P＜0.01);與B組比較，除C組下丘腦bcl-2外，C、D、E、F組海馬區和下丘腦bcl-2陽性細胞不同程度升高，而bax和capase-3陽性細胞數均有不同程度的降低(P＜0.05，P＜0.01);與F組比較，C、D、E組海馬區的bax陽性細胞數升高(P＜0.05，P＜0.01)，海馬區 bcl-2、caspase-3和下丘腦區bcl-2、bax、caspase-3陽性細胞數比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

3 討論

《內經》中記載:“肺朝百脈，輸精于皮毛，本末之寒溫相守司也，是謂平人。寒氣入經而稽留，寒獨留則血凝泣，血凝泣則脈不通。”現代研究表明，寒冷刺激首先使身體淺表的微動脈及小動脈收縮，表層血流減少，皮膚因之變為蒼白色。同時動靜脈吻合支開放增多，血液向靜脈回流加快，導致局部組織缺血缺氧，甚至壞死。寒冷刺激引起微循環障礙，血液黏度增高，血栓凝集導致血流瘀塞。我們采用腎上腺素加冰水浴復合低溫冷凍法制備寒凝氣滯血瘀證動物模型，更能接近機體在高寒缺氧環境下的病理過程，符合中醫證候特點，也與現代醫學的觀點相一致，且該模型具有操作方法簡單，模型穩定性好等優點。

細胞凋亡也稱程序性細胞死亡，是細胞接受生理或病理信號刺激后啟動的一種主動消亡過程，是保持組織細胞自穩態的一個基本過程，但過度凋亡則導致組織損傷，進而引起功能障礙［5］。細胞凋亡的調控機制是多方面的，其中細胞因子和bcl-2家族等對細胞凋亡有重要的調控作用。有研究表明細胞凋亡是多基因控制的細胞主動死亡過程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的協同控制。bcl-2和bax作為一對關系密切的凋亡相關基因，在中樞神經系統中均有表達，在神經細胞凋亡的控制中起重要作用［6］。bcl-2基因有促進細胞周期和細胞增殖的能力，其過度表達可特異性抑制細胞凋亡。bax基因的過度表達能加速白介素3(IL-3)細胞株在細胞因子缺失時發生細胞凋亡，并對抗bcl-2對細胞凋亡的抑制作用，從而促進細胞凋亡［7］。即bcl-2大量表達時，形成bcl-2同源二聚體，凋亡受到抑制;bax大量表達時，則形成 bax同源二聚體，細胞趨向凋亡［8］。Lu等［9］研究大鼠閉合性腦損傷后中樞神經系統神經元凋亡的時程，在4 h bax蛋白表達增高，并伴隨著bcl-2表達下調，在傷后l d處死的大鼠海馬區發現不同數量的TUNEL陽性細胞。彭申明等［10］研究顯示，雌激素和菟絲子總黃酮可抑制癡呆小鼠海馬區神經細胞凋亡率，可使抗凋亡蛋白bcl-2表達顯著升高，同時也明顯抑制癡呆小鼠促凋亡蛋白bax、caspase-3的表達，顯示其良好的抑制神經細胞凋亡的作用。

表1 6組大鼠海馬及下丘腦組織中細胞凋亡相關蛋白表達(x ± s，n=8)

圖1 6組大鼠海馬區bcl-2蛋白的表達(PV×400)A組為正常對照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖2 6組大鼠海馬區bax蛋白的表達(PV×400)A組為正常對照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖3 6組大鼠海馬區caspase-3蛋白的表達(PV×400)A組為正常對照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖4 6組大鼠下丘腦bcl-2蛋白的表達(PV×400)A組為正常對照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖5 6組大鼠下丘腦bax蛋白的表達(PV×400)A組為正常對照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖6 6組大鼠下丘腦caspase-3蛋白的表達(PV×400)A組為正常對照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

caspase即半胱氨酞天冬氨酸特異性蛋白酶，是特異的凋亡信號轉導分子，激活后的caspase是凋亡執行者，caspase的超表達和激活均引起細胞凋亡，因此又稱“死亡蛋白酶”。caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，其以不活躍的形式或酶原的形式存在于細胞中，其活性位點均含有半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。酶原的氨基端有一段被稱為“原結構域”的序列，酶原活化時將原結構域切除，同時分成小片段(12kDa)和(17kDa)兩個亞型才能有效。其表達上調表明凋亡通路被激活，細胞死亡增加［11］。郁志華等［12］研究發現疲勞結合中、大劑量普萘洛爾在造成大鼠心氣虛證模型的基礎上，其腦內皮層和海馬部位 bcl-2 mRNA表達明顯降低、海馬 caspase-3 mRNA表達明顯升高，說明其腦內皮層和海馬部位的神經細胞出現凋亡。李巾偉等［13］研究顯示，三七總皂甙能促進腦出血大鼠前腦內抑凋亡基因bcl-2 mRNA的轉錄和bcl-2蛋白的表達，抑制促凋亡基因capase-3 mRNA的轉錄及capase-3蛋白的裂解活化，減少細胞凋亡。

本研究采用的參姜鎖陽益氣片方中以西洋參、干姜、桂枝、白術為君藥，提高人體正氣，宣通血分，增強人體臟腑皮毛抗寒御寒能力;以麥冬、遠志、補骨脂、淫羊藿、枸杞子、巴戟天為臣藥，益肺，補腎，強心，護腦，固護命門，提高血管壁的感受器和促心肌收縮物質(兒茶酚胺)的功能、增強心腦排血量，使大動脈至小動脈毛細血管擴張功能增強，提高人體整體抗御高寒能力，抗御寒邪直傷五臟;紅花、當歸、阿膠、鎖陽為佐藥，與人體臟腑皮毛之四末，抗寒，御寒，耐寒，增加人體毛細血管壁通透載體，提高囊泡飽吐功能，建立毛細血管前括約肌，真毛細血管網捷徑運輸，使炅氣與滯血相通于脈中，致脈絡阻塞疏通至臟腑四末，使血之氣之諸迅速得以改善;以鹿茸、蓽拔為使藥，使上述信息速達于機體各處，快速改善由于高寒所造成的臟腑四末血滯，缺氧，功能減退，疲勞等癥候，達到陽中益陰，以整體統局部，使君臣佐使諸藥融為一體，發揮其祛寒益氣之功效。

本研究結果表明，與A組比較，B組海馬區和下丘腦bcl-2陽性細胞數明顯降低，bax和capase-3陽性細胞數明顯增加，我們既往的研究顯示，寒凝氣滯血瘀癥大鼠抗氧化系統功能也明顯降低［14］。提示在寒冷應激下，大鼠抗氧化清除自由基的功能減弱，導致血腦屏障通透性增加，腦組織水腫，從而引起神經細胞發生凋亡。與B組比較，C、D、E組海馬區和D、E組下丘腦bcl-2陽性細胞不同程度升高，而bax和capase-3陽性細胞數均有不同程度的降低。提示參姜鎖陽益氣片可能通過調節機體抗氧化系統功能，抑制神經細胞凋亡途徑而起到腦保護作用。

紅景天含有紅景天苷、酪醇、黃酮、多種微量元素、氨基酸、維生素A、C、D、E和超氧化物歧化酶等，具有益氣、活血、通脈等功效［15］。紅景天的免疫調節功效已被許多藥理實驗所證實［16-17］。大株紅景天膠囊主要成分紅景天苷、紅景天素及莖葉提取物，具有活血化瘀，通脈止痛的功效。有文獻報道，紅景天制劑可以降低人體全血黏度、血漿黏度，減少血小板聚集，改善血液流變學及血脂情況，可降低人體氧耗量，提高氧利用率［17-19］。本研究結果顯示，與B組比較，F組海馬區和下丘腦bcl-2陽性細胞不同程度升高，而bax和capase-3陽性細胞數均有不同程度的降低，而C、D、E組海馬區bax陽性細胞數較F組升高，提示紅景天對寒冷刺激引起的微循環障礙，局部組織缺血缺氧具有較好的療效。

綜上所述，參姜鎖陽益氣片可以影響腦組織中細胞凋亡相關蛋白表達，具有抗神經細胞凋亡的作用，從而起到腦保護作用。

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