參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證模型大鼠腦組織病理形態(tài)學和血腦屏障通透性的影響

賈丹兵，于 淼，李乃民，李春杰，唐立明，朱 宇，劉 珊

參姜鎖陽益氣片具有聚宗氣、暖身體、溫五臟、耐寒冷等作用。臨床主要用于防治寒冷環(huán)境中人體臟腑器官功能減退。有研究表明，參姜鎖陽益氣片能提高高寒地區(qū)運動性疲勞人群的耐寒及抗缺氧能力［1］。《景岳全書》記載:五臟六腑之辯，而總唯血氣為之用，然血無氣不行，血非氣不化。寒邪客于經(jīng)絡(luò)，以邪氣亂營氣，血泣而利也［2］。可見，寒冷、血瘀證、臟腑器官功能減退之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。本研究采用不同劑量參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠進行實驗研究，從腦組織病理形態(tài)學和血腦屏障通透性等方面探討參姜鎖陽益氣片防治寒冷環(huán)境中人體臟腑器官功能減退的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠36只，雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［許可證號SCXK(黑)2008004］，體重(200 ±20)g，常規(guī)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 實驗儀器及藥品

1.2.1 主要儀器:電子天平(上海梅德勒公司)，恒溫干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，722可見分光光度計(天津普瑞斯儀器有限公司)，顯微病理圖像分析系統(tǒng)(美國Motic公司)，2135型組織切片機(德國徠卡)，透射電鏡(荷蘭)。

1.2.2 主要藥品及試劑:參姜鎖陽益氣片主要由西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜、麥冬、補骨脂等組成，將處方中藥材按一定比例配好后密封罐蒸煮加壓，用水提取法濃縮、噴霧、干燥，獲取精純浸膏粉藥，制成片劑，每片 0.40 g(含有效成分 0.35 g，批號:20100702)。大株紅景天膠囊由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號:081108)。鹽酸腎上腺素注射液由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)(批號:1007121)，水合氯醛(天津科密歐化學試劑有限公司)，伊文思藍(美國Sigma公司)，二甲基甲酰胺(天津科密歐化學試劑有限公司)，其他常規(guī)化學試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型制備:隨機選取6只正常大鼠為A組，其余30只大鼠采用腎上腺素加冰水浴復合低溫冷凍法建立寒凝氣滯血瘀證大鼠模型［3］。方法如下:大鼠皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.08 ml/100 g，注射2次，間隔4 h，第1次注射給藥后2 h將大鼠置4℃冰水浸泡5 min，于第2日將大鼠分別放入低溫冷柜鼠籠中，在-20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4 h，每日1次，連續(xù)7 d。30只大鼠隨機分為B、C、D、E、F組，每組 6只，分別編號、標記、稱重。

1.3.2 給藥方法:各組在末次造模后1 h，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥2周，給藥劑量按成人每日每公斤體重用量進行折算如下:C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片劑量為70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊劑量為280 mg/kg;A和B組給予等體積生理鹽水。

1.4 病理形態(tài)學觀察 大鼠麻醉固定后迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至升主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。4℃生理鹽水200 ml快速灌注，之后稍減慢灌注速度沖洗至流出液清亮，大鼠斷頭后快速于冰盤上取出全腦，在視交叉后4 mm處冠狀切開腦組織，厚度約5 mm，放入4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色。另取腦組織大小為1 mm×1 mm×1 mm，立即放入2.5%戊二醛-多聚甲醛溶液中固定，用于電鏡觀察。

1.4.1 光鏡HE染色:石蠟組織切片HE染色方法:取組織塊，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，5μm切片;切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗:二甲苯(Ⅰ)5 min，甲苯(Ⅱ)5 min，100% 乙醇(Ⅰ)5 min，100%乙醇(Ⅱ)5 min，90% 乙醇 5 min，80% 乙醇5 min，70%乙醇5 min，蒸餾水洗5 min;蘇木素染色5 min，自來水沖洗10 min;1%鹽酸乙醇分化30 s;蒸餾水浸泡5 min;置伊紅液復染3 min;常規(guī)脫水，透明，封片:70%乙醇5 min，80%乙醇5 min，90%乙醇5 min，100% 乙醇(Ⅰ)5 min，100% 乙醇(Ⅱ)5 min，二甲苯(Ⅰ)5 min，二甲苯(Ⅱ)5 min，中性樹脂封固。顯微鏡下觀察。

1.4.2 電鏡負染色:將所取大小為1 mm×1 mm×1 mm腦組織立即放入2.5%戊二醛-多聚甲醛溶液固定24 h;1%的四氧化鋨固定;30%、50%乙醇脫水各15 min;70%醋酸鈾乙醇飽和液中固定6～12 h;80%、90%乙醇脫水各15 min;無水乙醇脫水2次，各40 min;環(huán)氧丙烷30 min;環(huán)氧丙烷:環(huán)氧樹脂(1∶1)、環(huán)氧丙烷:環(huán)氧樹脂(1∶2)1 h;浸環(huán)氧樹脂2 h;環(huán)氧樹脂包埋后入45℃烤箱12 h;65℃干燥箱48 h;取出包埋后組織進行超薄切片;切片水洗后放入醋酸鈾飽和液中30 min;雙蒸水洗滌3次各15 min;入枸櫞酸鉛染液15 min;雙蒸水洗滌3次各10 min;透射電鏡觀察攝片。

1.5 血腦屏障通透性和腦組織含水量檢測

1.5.1 血腦屏障通透性測定:采用伊文思藍(EB)灌注法檢測大鼠腦組織血腦屏障通透性變化。各組大鼠處死前1 h，尾靜脈注入2%EB(2 ml/kg)，麻醉后打開胸腔，灌注肝素生理鹽水(生理鹽水加20 U/ml肝素)200～300 ml，斷頭取腦矢狀分成兩部分，稱重后，一側(cè)作腦組織含水量測定，另一側(cè)剪碎置于二甲基甲酰胺(1 ml/100 g腦組織)，60℃孵育24 h，1000 r/min離心5 min，取上清液測其吸光度(OD)值，波長632 nm，蒸餾水作空白比色，按標準曲線計算EB含量，結(jié)果以μg/g表示。

1.5.2 腦組織含水量測定(干濕重法):取出一側(cè)大腦，用預冷的D2Hank液清洗組織表面的血跡，濾紙吸干，去除白質(zhì)。用電子天平(精確到0.001 g)在干凈的蓋玻片上準確稱量大鼠相同區(qū)域腦組織100 mg(組織濕重)，放入高溫烤箱中烘烤(180℃，6 h)，待樣品在烤箱中自然冷卻后再次稱量組織的重量(組織干重)并記錄。將稱量的重量數(shù)據(jù)代入下式計算腦組織含水量:γ=(組織濕重-組織干重)/組織濕重×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學變化

2.1.1 光鏡:主要對海馬區(qū)和下丘腦中神經(jīng)元細胞進行了詳細的觀察。A組:可見海馬區(qū)和下丘腦中神經(jīng)元細胞排列緊密，數(shù)目較多，神經(jīng)細胞胞質(zhì)豐富，細胞核圓形，無核固縮及溶解現(xiàn)象，染色均勻，無膠質(zhì)細胞增生。B組:與A組比較，大鼠海馬區(qū)和下丘腦中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)紊亂，多呈散在分布，神經(jīng)細胞體積明顯縮小，胞核固縮深染，膠質(zhì)細胞明顯增生，可見有大量的炎性細胞存在。與B組比較，C、D、E、F組大鼠海馬區(qū)和下丘腦組織病理變化均有不同程度改善，表現(xiàn)為神經(jīng)元排列較規(guī)整，染色較均勻，數(shù)目較多，細胞核固縮減少，膠質(zhì)細胞和炎細胞數(shù)目減少。F組與D組改善程度相似。以E組改善最顯著。見圖1～2。

2.1.2 電鏡:主要對腦組織中神經(jīng)元和血管等進行了詳細的觀察。A組:神經(jīng)細胞連接緊密，突觸及突觸小泡數(shù)目正常，胞核呈圓形較規(guī)則，核膜清晰，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器未見異常，胞質(zhì)內(nèi)核糖顆粒豐富，溶酶體和脂褐素較少;毛細血管基底膜結(jié)構(gòu)正常，無水腫及炎性細胞浸潤。B組:與A組比較神經(jīng)元間隔加大，突觸數(shù)量明顯減少，突觸小泡融合、水腫嚴重，神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)明顯皺縮，核膜融合，核形異常，異染色質(zhì)聚集，線粒體腫脹不活躍，核糖體嚴重脫顆粒;毛細血管基膜雙層結(jié)構(gòu)不清晰，周圍星形膠質(zhì)細胞腫脹嚴重。與B組比較，C組神經(jīng)元、細胞器及細胞之間的連接、毛細血管在鏡下未見明顯的改善。D組和F組神經(jīng)元皺縮明顯減輕，突觸數(shù)量明顯增多;胞核欠規(guī)則，核膜可偶見階段性融合。E組神經(jīng)元之間界限尚清晰，連接較緊密;胞核形態(tài)基本正常，核糖體未見數(shù)量增多，線粒體結(jié)構(gòu)基本正常;毛細血管周圍腫脹減輕明顯。見圖3～4。

圖1 6組大鼠海馬區(qū)光鏡下病理形態(tài)(HE×400)A組為正常對照組，僅給予等體積生理鹽水;B組為模型組，給予等體積生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片劑量為70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊劑量為280 mg/kg

圖2 6組大鼠下丘腦光鏡下病理形態(tài)(HE×400)A組為正常對照組，僅給予等體積生理鹽水;B組為模型組，給予等體積生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片劑量為70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊劑量為280 mg/kg

圖3 6組大鼠腦組織中神經(jīng)元透射電鏡下病理形態(tài)(負染色×4200)A組為正常對照組，僅給予等體積生理鹽水;B組為模型組，給予等體積生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片劑量為70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊劑量為280 mg/kg

圖4 6組大鼠腦組織中血管透射電鏡下病理形態(tài)(負染色×6000)A組為正常對照組，僅給予等體積生理鹽水;B組為模型組，給予等體積生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片劑量為70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊劑量為280 mg/kg

2.2 血腦屏障通透性 與A組比較，B組EB含量和腦組織含水量升高(P＜0.01);與B組比較，C、D、E、F組 EB含量和腦組織含水量均顯著降低(P＜0.01);與F組比較，C、D組EB含量和腦組織含水量明顯增高，E組僅腦組織含水量降低(P＜0.05，P＜0.01)，EB含量與F組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 6組大鼠伊文思藍含量及腦組織含水量變化(x±s)

3 討論

本研究針對寒凝氣滯血瘀證證候形成特點，采用參姜鎖陽益氣片達到溫熱祛寒，益肺補腎，通經(jīng)活絡(luò)的效果。參姜鎖陽益氣片方中以西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜為君藥，溫中祛寒行血，重在針對高寒缺氧所致的寒厥氣衰;以麥冬、補骨脂、淫羊藿等為臣藥，益肺補腎，以御寒邪直傷五臟六腑之功;以鎖陽、紅花等為佐藥，祛除寒邪所致臟腑缺血少氣之諸癥;以鹿茸、蓽拔為使藥，陽中益陰又調(diào)和諸藥。大株紅景天具有益氣活血通脈的功效［4］，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《四部醫(yī)典》、《本草綱目》、《千金翼方》等著作中均有詳細記載:味甘、苦、澀，性涼，善潤肺，能補腎，理氣養(yǎng)血［5］，其為景天科紅景天的多年生草本植物，被譽為“高原人參”［6］。有研究表明，紅景天具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用［7］，在預防、治療腦部缺血和神經(jīng)退行性疾病方面具有潛在價值［8］。以此為依據(jù)，我們選用大株紅景天為參姜鎖陽益氣片的中藥對照藥材，并將其療效與參姜鎖陽益氣片不同劑量組加以比較，以初步確定參姜鎖陽益氣片保護腦組織的大致用量。

本實驗通過光鏡、電鏡檢測發(fā)現(xiàn)B組腦組織中出現(xiàn)神經(jīng)元細胞水腫、膠質(zhì)細胞增多及毛細血管水腫等病理學改變，經(jīng)不同劑量參姜鎖陽益氣片治療后這些病理變化有不同程度的改善，并且D組的改善程度與F組相近，提示在腦組織病理形態(tài)學改善方面D組與F組療效最相近。

血腦屏障是存在于血液與腦組織之間的屏障結(jié)構(gòu)，可阻止多種物質(zhì)進入腦部，但營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物可順利通過，從而維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定［9］。血腦屏障結(jié)構(gòu)的損傷可導致腦內(nèi)微環(huán)境的變化，從而引起腦神經(jīng)細胞功能、代謝與結(jié)構(gòu)的改變［10］。而血腦屏障損傷中通透性變化是最基本也是最直接的損傷體現(xiàn)。EB進入血液與血漿蛋白結(jié)合后不能通過血腦屏障，只有當血腦屏障破壞時才能通過受損的血腦屏障進入腦組織，因此常用作腦血管通透性變化的指示劑［9］。

本研究結(jié)果表明，與A組比較，B組大鼠腦組織中EB含量顯著增高，不同劑量參姜鎖陽益氣片能夠不同程度降低腦組織EB含量。與F組比較，C、D組腦組織EB含量有明顯增高，E組與F組比較無明顯差異，提示在血腦屏障通透性方面E組與F組療效最相近。血腦屏障受損血管通透性增高的另一判斷因素是檢測腦組織的含水量［11］。本研究結(jié)果顯示，與A組比較，B組腦組織含水量增高，與B組比較，不同劑量的參姜鎖陽益氣片能夠降低腦組織含水量。與F組比較，C、D組腦組織含水量有顯著性增高，而E組與F組比較差異(下轉(zhuǎn)47頁)保護的作用。

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