CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性及患者臨床特征對心臟瓣膜置換術后華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響

陳曉英，彭 齊，何 蕾

心臟機械瓣膜置換術后容易血栓形成或栓塞，需口服華法林抗凝治療［1-2］，但口服華法林抗凝需要監(jiān)測國際標準化比值(INR)，要將INR控制在2.0～3.0，治療窗較窄，且華法林劑量亦存在個體差異，要達到相同的抗凝效果，劑量差異極大［2］。即使INR值在目標范圍內(nèi)仍有部分患者出現(xiàn)出血并發(fā)癥。目前新型的抗凝作用肯定、劑量固定、無須監(jiān)測凝血指標的口服抗凝劑——達比加群酯在非瓣膜病心房顫動患者的抗凝治療中逐漸被認可［3-4］，但在心臟機械瓣膜置換術后患者中的應用尚無研究報道，因此，目前口服華法林仍然是心臟瓣膜置換術后抗凝的標準治療方法。國內(nèi)外研究顯示，華法林穩(wěn)態(tài)劑量的個體差異與細胞色素P450酶2C9(CYP2C9)基因和維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1(VKORC1)基因多態(tài)性有關［1-2］。本文旨在研究湖北地區(qū)漢族人群中是否存在CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性以及患者的臨床特征和不同的基因型對華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2012年3—12月在武漢亞洲心臟病醫(yī)院心臟外科行心臟機械瓣膜置換術患者131例。入選標準為:湖北省內(nèi)＞18歲漢族人(相互間無血緣關系及異族通婚史)、術后口服華法林抗凝、INR控制在2.0～3.0。排除標準:肝、腎及甲狀腺功能異常;服用胺碘酮、利福平及巴比妥等影響華法林藥動學效果的藥物;服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等影響INR的藥物。

1.2 方法

1.2.1 標本采集:收集入選受試者的靜脈血(枸櫞酸鈉抗凝)3 ml用于檢測 INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同時記錄患者年齡、身高、體重及華法林穩(wěn)態(tài)劑量。

1.2.2 實驗方法:從血液中提取患者DNA，擴增目的片段，再進行測序反應，采用聚合酶鏈反應-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCB-RFLP)技術檢測CYP2C9和VKORC1基因型。DNA提取采用TIANGEN血液基因組提取試劑盒，測序儀為美國 ABI 3500 Genetic Analyzer。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，Pearsonχ2檢驗用于檢查基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，Spearman等級相關用于分析華法林劑量與年齡、身高、體重以及INR值的關系，CYP2C9、VKORC1基因型之間華法林劑量的比較使用兩樣本t檢驗，多元線性回歸用于分析華法林劑量與各變量之間的相關性，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 基因型分布 在131例患者中，CYP2C9*3基因型AA 125例(95.42%)，AC 6例(4.58%)，無CC型患者;VKORC1基因型AA 105例(80.15%)，GA 25例(19.08%)，GG 1例(0.77%)。此結(jié)果與文獻報道一致［5-6］。

2.2 不同基因型患者的臨床資料及華法林穩(wěn)態(tài)劑量比較 131例患者的CYP2C9基因型檢測有125例為*1/*1型、6例為*1/*3型、未發(fā)現(xiàn)*2突變;華法林劑量分別為(2.69±1.07)mg/d、(1.50±0.82)mg/d，*1/*3型較*1/*1型華法林需求量少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。VKORC1基因型檢測有105例為AA型、25例為雜合子GA型、1例為純合子GG型;華法林劑量分別為(2.47±0.96)mg/d、(3.30±1.32)mg/d，AA 型較 GA 型華法林需求量少，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01);VKORC1基因型GG型僅1例，未做組間比較。見表1。

表1 不同基因型患者的臨床資料及華法林穩(wěn)態(tài)劑量的比較(x±s)

2.3 影響患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量的相關因素分析分別對年齡、身高、體重、兩種基因型與華法林穩(wěn)態(tài)劑量行直線相關分析顯示，華法林穩(wěn)態(tài)劑量與患者的年齡及不同的基因型有關(P＜0.05)，見表2;同時納入患者年齡、身高、體重、不同基因型，行多元回歸分析顯示，華法林穩(wěn)態(tài)劑量與CYP2C9、VKORC1基因型和年齡有關(P＜0.05)，見表3。

表2 華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響因素直線相關分析

表3 華法林穩(wěn)態(tài)劑量影響因素多元回歸分析

3 討論

口服抗凝藥華法林廣泛應用于臨床，但其劑量在不同種族間及個體間存在較大差異，影響華法林劑量的因素中，個體因素包括種族、遺傳、性別、年齡、身高、體重等;臨床因素主要表現(xiàn)在藥物間相互作用，如:影響華法林藥代動力學的藥物有胺碘酮、利福平及巴比妥等;影響凝血的藥物有阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等［7］。其中遺傳因素可解釋40% ～74%的個體劑量差異［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9和VKORC1基因與華法林藥代學和藥效學相關。在藥代學方面，CYP2C9是CYP2C亞家族中的一種同工酶，也是許多藥物的重要代謝酶，約占肝微粒體中CYP總量的20%，其基因多態(tài)性可影響代謝酶活性，特別是存在基因突變的個體藥物不良反應的發(fā)生率更高;在藥效學方面，VKORC1基因啟動子區(qū)-1639位基因G突變?yōu)锳后轉(zhuǎn)錄活性下降，其基因多態(tài)性影響華法林臨床用藥劑量［8-9］。

本研究結(jié)果顯示，131例中 CYP2C9基因型檢測有125例為*1/*1型、6例為*1/* 3型、未發(fā)現(xiàn)*2突變，以等位基因A為主，其基因型頻率分別為95.42%、4.58%、0，與文獻報道的國人的基因型頻率一致［5-6］。Aquilante 等［10］的研究提示在西方人群中CYP2C9的等位基因同樣是以A為主，說明其等位基因分布未存在人種差異。本研究中未發(fā)現(xiàn)*2突變，可能與病例數(shù)少有關。因為CYP2C9基因存在很多多肽位點，在中國人群中CYP2C9*2和CYP2C9*3的變異位點相對更多，隨著華法林基因監(jiān)測的普及，可能會發(fā)現(xiàn)更多的基因突變位點。

本研究中VKORC1基因型檢測有105例為AA型、25例為雜合子GA型、1例為純合子GG型，以AA型居多，其基因型頻率分別為80.15%、19.08%、0.77%，與文獻報道的國人的基因型頻率一致［5-6］。同時有文獻報道，在高加索人和非洲裔美國人中VKORC1基因以GG、GA型占大多數(shù)［11］，提示在不同種族間VKORC1基因多態(tài)性分布存在人種差異。

本研究結(jié)果顯示，在湖北地區(qū)漢族人群中存在CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性，且不同基因型患者間華法林用量存在差異，CYP2C9*1/*3型較*1/*1型華法林需求量少。分析原因可能是CYP2C9是許多藥物的重要代謝酶，其基因多態(tài)性可影響代謝酶活性，特別是對于存在基因突變的個體的藥代學影響更顯著，具體到華法林的代謝則表現(xiàn)為突變型的CYP2C9*1/*3型比野生型*1/*1型對華法林的代謝能力下降，導致患者服用相對較低劑量的華法林即可治療達標［12］;VKORC1基因位于16號染色體，含3個外顯子，編碼163個氨基酸的18KDa內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白。此蛋白質(zhì)為組成維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位之一，主導維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點。VKORC1基因啟動子區(qū)-1639G＞A多態(tài)性與華法林臨床用藥劑量相關，AA基因型華法林需求較GA和GG型低。因此，CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性是造成個體間華法林穩(wěn)態(tài)劑量差異的主要原因［11-12］。

影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等［13］。本研究分別對年齡、身高、體重、兩種基因型與華法林穩(wěn)態(tài)劑量行直線相關和多元回歸分析均顯示，華法林穩(wěn)態(tài)劑量與CYP2C9、VKORC1基因型和年齡有關。本研究結(jié)果未顯示華法林穩(wěn)態(tài)劑量與身高和體重的相關性，可能與樣本量偏少有關。我們將在以后的研究中進一步關注和探討此問題。

華法林的應用范圍不只限于心臟瓣膜置換術后，在肺栓塞、持續(xù)性心房顫動及反復靜脈血栓形成的患者中亦需要口服華法林抗凝，同時需要控制INR在目標范圍，而反復的抽血檢測及調(diào)整亦帶來諸多不便。我院目前對臨床需要口服華法林的患者進行基因型檢測，通過基因分型及計算機劑量模型預測華法林穩(wěn)態(tài)劑量，以指導臨床選擇合適的華法林劑量并盡量縮短藥物劑量的調(diào)整周期，希望能借此減少患者反復抽血檢測以及降低患者血栓和出血的風險。

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