CYP2C9及VKORC1基因多態性對心臟瓣膜置換術后華法林個體劑量差異的研究

彭 齊，陳曉英，宋 杰

華法林是目前臨床最常用的口服抗凝藥物，但其用藥劑量在不同種族間及個體間存在較大差異，甚至可相差10～20倍［1-2］。即使使用相同抗凝劑量，不同個體發生出血或血栓事件概率也不同，這與個體差異有關。近年研究顯示，細胞色素P450酶2C9基因(CYP2C9)和維生素K環氧化物還原酶復合體1基因(VKORC1)多態性是造成個體間華法林維持劑量差異的主要原因［3-4］。本文旨在研究湖北地區漢族人群中CYP2C9和VKORC1基因多態性分布特點及基因變異位點對華法林穩態劑量的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2012年3—8月在武漢亞洲心臟病醫院心臟外科行心瓣膜置換術患者108例為華法林組，入選標準為:漢族、＞18歲、穩定華法林抗凝至少3個月、國際標準化比值(INR)控制在2.0～3.0。排除標準:肝、腎及甲狀腺功能異常;服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等影響INR的藥物。所有入選對象均來自湖北省各地區就診的漢族居民，相互間無血緣關系及異族通婚史。選擇同期健康受試者85名為對照組。華法林組男50例，女58例，年齡(50.51±13.10)歲;對照組男39例，女46例，年齡(48.78±12.82)歲。兩組年齡、性別比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標本采集:收集入選受試者的靜脈血(枸櫞酸鈉抗凝)3 ml用于檢測 INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同時觀察患者年齡、性別、體重、身高及華法林穩態劑量。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 總DNA提取:采用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取樣本的血液基因組DNA，1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測總基因組條帶。

1.2.2.2 目的片段的PCR擴增:引物由大連寶生物公司合成(表1)，采用50μl的反應體系進行擴增(表2)，反應條件:94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，50 ～65℃退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，共 30個循環，72℃保溫10 min。PCR反應在 ABI 9700 PCR儀上進行，采用2.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，得到預期大小的片段后，采用百泰克PCR產物回收試劑盒對目的片段進行純化回收。

1.2.2.3 目的片段的測序反應:對目的片段進行測序PCR反應后，并對測序PCR產物進行純化。最后把目的片段上機測序并讀取結果(圖1～3)，測序儀為ABI 3500基因分析儀。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件，Pearsonχ2檢驗用于檢查基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，Spearman等級相關用于分析華法林劑量與年齡、身高、體重以及INR值的關系，CYP2C9、VKORC1基因型之間華法林穩態劑量的比較使用兩樣本t檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 基因型分布 兩組中基因型分布與華法林國際藥理學聯盟(IWPC)提供的臨床和遺傳學數據相符［1］。兩組CYP2C9和VKORC1基因型頻率和等位基因頻率分布比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3～4。

2.2 不同基因型患者臨床資料及華法林穩態劑量的比較 108例CYP2C9和VKORC1基因型臨床資料比較差異無統計學意義(P＞0.05)，但CYP2C9基因*1/* 3型較*1/*1型華法林穩態劑量小，VKORC1基因AA型較GA型華法林穩態劑量小(P＜0.05，P ＜0.01)，VKORC1基因型 GG 型僅 3例，未做比較，見表5。

表1 擴增VKORC1-1639G＞A、CYP2C9*2和CYP2C9*3目的片段的上下游引物

表2 擴增VKORC1-1639G＞A、CYP2C9*2和CYP2C9*3目的片段的反應體系

圖1 VKORC1-1639G＞A測序結果

2.3 基因序列 37例較長時間達到目標INR且穩態劑量不太穩定的患者基因非檢測位點突變很多，見圖4。CYP2C9基因變異位點非常多的患者和大多數人的基因圖譜見圖5～6。

2.4 非典型突變氨基酸表達情況 除了檢測的3個多態位點，還發現了50余個變異位點，在這些變異中有14種變異引起了氨基酸表達的變化。這些非典型變異中有一些文獻報道的如 rs28371686、rs28371685、rs5750570等。無文獻報道的有8種，包括CYP2C9*2 Ile 177 Leu(A→C)55例(50.9%，MAF 25.5%)，CYP2C9*3 His 353 Asp(C→G)5例(4.63%，MAF 2.31%)，VKORC1-1691(T＞G)1例(0.93%，MAF 0.46%)，其中CYP2C9*3 His 353 Asp的變異可能對蛋白質的活性影響比較大，因為組氨酸(His)為酸性帶正電荷，天冬氨酸(Asp)為堿性帶負電荷，兩種氨基酸性質相差太大。現檢測華法林用量的3個基因位點，其MAF分別為8%、4.2%和＜0.1%。我們發現的上述3個位點的MAF已經和這通用的3個位點相當。

圖2 CYP2C9*2測序結果

圖3 CYP2C9*3測序結果

表3 兩組CYP2C9基因型頻率和等位基因頻率分布［例(%)］

表4 兩組VKORC1基因型頻率和等位基因頻率分布［例(%)］

表5 CYP2C9和VKORC1不同基因型患者臨床資料及華法林穩態劑量的比較(x±s)

圖4 兩批樣本基因序列比較非黑色部分表示此位點有樣本突變;a.穩態劑量穩定樣本;b.穩態劑量不穩定樣本

圖5 CYP2C9*3基因變異位點多的患者基因圖譜

圖6 多數人CYP2C9基因圖譜

3 討論

影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等。華法林IWPC發表的研究顯示，加入藥物基因組學的預測模型(包括基因型)比臨床預測模型(不包括基因型)準確性提高了80%［1］。所以個體的遺傳特征對于華法林的劑量影響很大［2-4］。目前研究發現與華法林藥效學和藥動學相關的基因達30多種，其中起主要作用的有CYP2C9和VKORC1基因［5-6］。美國FDA在華法林用藥說明書中介紹了 CYP2C9和VKORC1基因對劑量的影響并建議在用藥之前做基因檢測。

CYP2C9是人類肝臟中一種重要的由CYP超基因家族編碼的藥物代謝酶系統。CYP2C9是CYP2C亞家族中的一種同工酶，約占肝微粒體中CYP總量的20%。CYP2C9基因存在很多多肽位點，研究較多的也最常見的是CYP2C9*2和CYP2C9*3。在中國人群中CYP2C9*3變異位點相對更多［6-7］，主要是第359位的氨基酸由異亮氨酸變成亮氨酸。CYP2C9*2和CYP2C9*3突變攜帶者華法林劑量需求較野生型患者低，且CYP2C9*3攜帶者出血風險較高［5］。VKORC1基因位于16號染色體，此蛋白質為組成維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位之一，主導維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點。VKORC1基因啟動子區-1639G＞A多態性與華法林臨床用藥劑量相關，AA基因型華法林劑量需求較AG和GG型低。在中國患者中三者的頻率分別是79.7%、17.6%和2.7%。

本研究探討了湖北地區漢族人群中這兩種基因型的分布、不同基因型患者需要的華法林穩態劑量比較以及年齡、身高、體重與華法林穩定劑量的關系。在湖北地區漢族人群中，存在 CYP2C9和VKORC1基因多態性，且不同基因型患者間華法林用量存在差異，CYP2C9*1/*3型較*1/*1型華法林需求量少，考慮突變型的CYP2C9酶(中國人群中主要為*1/*3)與野生型(*1/*1)酶相比，對華法林的代謝能力下降，導致患者對華法林治療敏感，故所需劑量減少［8-9］;VKORC1 AA型較GA型華法林需求量少，VKORC1啟動子的基因多態性是影響華法林穩態劑量種族差異和個體差異的主要因素，華法林敏感者的基因型為純合子AA，而華法林抵抗者則為基因型 GA或者 GG，進一步說明CYP2C9和VKORC1的基因多態性是造成個體間華法林穩態劑量差異的主要原因［10］。

以往眾多研究已表明，影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等［11-12］。我們將在以后的研究中進一步關注和探討此問題。鑒于CYP2C9和VKORC1的不同基因型華法林用量存在明顯差異，本中心目前對臨床需口服華法林的患者進行基因型檢測，并根據基因分型指導華法林初始劑量的選擇，希望能借此減少患者反復抽血檢測，以及降低抗凝出血的風險［13-14］。

本研究中37例INR維持量不太穩定的患者，非檢測位點突變很多，提示除目前3個位點外仍有其他位點變異因素，如果其中任何一個被證明和華法林用藥相關，都會是一個重要的發現，對臨床用藥、科學研究都會有較大的影響。目前需要更多的樣本、數據給予支持。近年來，隨著研究的深入，針對國人華法林劑量構建的預測模型已越來越多，且納入了遺傳因素，可解釋約40% ～74%的個體劑量差異［15］。但是，目前基于中國人群構建的劑量預測模型存在樣本量較小、納入的影響因素少，以及缺少外部驗證等弊端。因此，我們需要更大樣本量的研究，對已構建的模型進行驗證或是構建新模型。我們也需要納入更多的遺傳和非遺傳因素，以期提高對華法林個體差異的解釋百分比。

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