褐藻多糖硫酸酯在小鼠N2a細胞缺血再灌注損傷中的作用

李珊珊，徐志偉，桑文文，王偉英，楊 旭

缺血性腦卒中(ischaemic stroke，IS)是我國致殘和致死的主要疾病之一，目前雖然針對IS的治療方法有很多，但唯一有效的治療方法就是溶栓療法，患者受治療窗和禁忌證的限制使得溶栓的治療不能廣泛應用。氧化應激在IS中起重要作用，NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)最近已被證明在生理條件下是調節氧化應激的重要轉錄因子［1］。褐藻多糖硫酸酯(fucoidan，FPS)是一種天然來源的海藻多糖，具有多種生物活性，尤其是其抗炎和抗氧化活性近年來受到了學者的廣泛關注［2］。羅鼎真等［3］通過大鼠腦缺血再灌注損傷后腹腔內注射FPS檢測大鼠神經功能評分和腦梗死的面積，發現FPS對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，但是機制仍不明確。國內外的研究表明，FPS可以抑制活性氧自由基的生成并促進其清除，從而表現出抗氧化活性。我們前期的研究亦發現FPS對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，能夠增加Nrf2的表達。故而我們在細胞離體水平上，建立小鼠 N2a細胞氧糖剝奪/復糖復氧(OGD/R)模型，模擬腦缺氧缺血損傷的病理過程，觀察FPS對OGD/R引起N2a細胞損傷的保護作用，并進一步探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鼠源性 β-actin抗體(Sigma:A1978)、蛋白酶抑制劑(Roche:4693132001)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠二抗(Gibco，A16066，A16110);ECL發光試劑盒(Gibco，WP20005);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific，23209);凋亡試劑盒CytoTox 96@非放射性細胞毒性檢測試劑盒(Promega，G1780);Bio-MaxMR X-線膠片(Kodak公司)。

1.2 N2a細胞及OGD/R模型制備 小鼠N2a成神經瘤細胞(購自協和細胞中心)，常規培養于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖，Gibco公司)完全培養基中，并置入37℃、含21%O2、5%CO2和74%N2常氧混合氣體、飽和濕度培養箱內培養，24 h換液，2～3 d傳代。將N2a細胞分成對照組、OGD/R模型組、FPS處理組，其中OGD/R模型組細胞使用無糖Earle＇s平衡鹽溶液替換正常的細胞培養液，將其置于37℃含體積分數0.95 N2和0.05 CO2的混合氣體的培養箱，2 h后換正常培養液，然后正常培養條件繼續培養24 h。對照組細胞使用有糖Earle＇s平衡鹽溶液正常條件培養2 h后，再換正常培養液正常條件繼續培養24 h。FPS處理組在造OGD/R模型前24 h 加入1、2、5、10 μg/ml的PFS 孵育。

1.3 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測定 各組細胞按實驗要求處理后，每孔加入含0.5 g/L MTT細胞培養液150μl培養4 h。棄上清，每孔加 DMSO 150μl，37℃ 振搖孵育15 min，酶標儀490 nm波長檢測光密度值，來計算細胞生存率。此值越高代表N2a細胞存活率越高。

1.4 乳酸脫氫酶(LDH)測定 各組細胞按實驗要求處理后，收集各組培養液上清，然后使用體積分數0.002 TritonX-100破膜，再次收集各組細胞液體，根據試劑盒說明書分別測得上清和細胞中的LDH活力，計算上清LDH/總LDH值，來確定細胞壞死水平。此值越高代表N2a細胞死亡率越高。

1.5 Western blot檢測 提取全細胞蛋白、BCA法定量，-80℃保存備用。每組樣品取30μg蛋白進行電泳(10%SDS-PAGE，4℃，20～30 mA)和轉膜(PVDF膜，300 mA，2 h)。先后用兔源性抗 HO-1(1∶1000)和鼠源性 β-actin(1∶1000)一抗，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔/鼠二抗(1∶5000)進行免疫雜交;然后用ECL發光，X線曝光、顯影、定影。所得結果用Gel Doc凝膠成像系統掃描后，對目的蛋白進行定量分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差(x±s)表示，采用單因素方差分析及SNK-q檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 FPS對抗OGD/R誘導N2a細胞損傷的作用與對照組比較，MTT測定顯示OGD/R模型組和不同濃度FPS處理組N2a細胞存活率均顯著降低(P＜0.05，P ＜0.01)，當FPS≤5 μg/ml時具有顯著性差異(P＜0.01);與OGD/R模型組比較，MTT結果顯示 FPS處理組N2a細胞存活率升高，FPS≥5μg/ml時具有顯著性差異(P＜0.01)，見表1。與對照組比較，LDH測定顯示OGD/R模型組和不同濃度FPS處理組N2a細胞死亡率均顯著升高(P＜0.05，P ＜0.01)，當 FPS≤5 μg/ml時具有顯著性差異(P＜0.01);與OGD/R模型組相比，LDH檢測結果顯示 FPS處理組N2a細胞死亡率降低，FPS=10.0μg/ml時具有顯著性差異(P＜0.01)，見表1。

表1 FPS對OGD/R小鼠N2a細胞存活率和死亡率的影響(x±s)

2.2 FPS增加Nrf2的核轉位 Western blot檢測結果顯示，OGD/R模型組N2a細胞Nrf2的核轉位灰度值為1.20±0.10，較對照組增加(P＜0.05);其不同濃度(1、2、5、10 μg/ml)FPS均能促進 Nrf2的核轉移，其灰度值分別為1.63±0.21、2.30±0.20、2.80±0.10、2.90±0.26，與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，且在FPS≥2μg/ml時對Nrf2的核轉移促進作用較明顯(P＜0.01);與OGD/R模型組相比，不同濃度FPS組Nrf2的核轉移均增加，FPS≥2μg/ml差異具有顯著意義(P ＜0.01)，見圖1。

2.3 FPS增加Nrf2下游蛋白血紅素加氧酶(HO-1)的表達 Western blot檢測結果顯示，OGD/R模型組N2a細胞HO-1的表達量為1.13±0.12，但與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05);不同濃度(1、2、5、10 μg/ml)FPS 組 HO-1 的表達分別為1.47 ±0.15、2.30 ±0.20、2.47 ±0.15、2.83 ±0.15，均較對照組增加(P＜0.05，P＜0.01)，當 FPS＞2μg/ml時差異具有顯著意義(P＜0.01)。與OGD/R模型組比較，FPS各濃度組HO-1的表達均增加(P ＜0.05，P＜0.01)，當 FPS＞2 μg/ml差異具有顯著意義(P＜0.01)，見圖2。

圖1 Western blot檢測FPS對OGD/R小鼠N2a細胞核轉位的影響 OGD/R:氧糖剝奪/復糖復氧;Nrf2:NF-E2相關因子2;Histon H3:內參照

圖2 Western blot檢測FPS對OGD/R小鼠N2a細胞Nrf2下游蛋白HO-1表達的影響 OGD/R:氧糖剝奪/復糖復氧;Nrf2:NF-E2相關因子2;HO-1:血紅素加氧酶1

3 討論

N2a細胞是小鼠來源神經瘤母細胞，是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle經A株白鼠的自生腫瘤建立，該細胞貼壁，已在多個實驗室培養并成功建立體外氧糖剝奪(OGD)模型［4-5］。OGD模擬體內腦缺血過程是一個良好的并且經典的模型［6-7］，氧化損傷增加的標志物可以在這個模型中觀察到［8-9］。

氧化應激是由于各種原因破壞了組織細胞的氧化和抗氧化平衡，致使ROS形成過多或者清除不足而形成的損傷狀態。ROS的產生可導致如生物膜結構和功能的改變、損傷DNA導致細胞突變等一系列有害作用。因此，保持體內ROS的平衡對維持正常過程至關重要。近年來，多項研究提示，多糖具有提高抗氧化酶活性、清除自由基等作用，在保護生物膜中發揮著重要作用。其中，FPS作為一種具有生物活性的硫酸化多糖，主要存在于藻類和棘皮動物中，具有顯著的體外抗氧化活性，對-OH、O2-具有良好的清除作用，可降低血清中過氧化脂質含量，同時顯著提高組織中超氧化物歧化酶的含量。范瑩等［10］研究表明Fu可以降低大鼠的神經功能評分，縮小大腦梗死體積;并在SH-SY5Y細胞上驗證了Fu可以減輕缺糖缺氧對細胞的毒性作用，并降低細胞的凋亡率，但是其機制尚不清楚。本研究結果發現，在N2a細胞OGD/R模型中應用FPS可顯著提高細胞存活率，并呈濃度依賴性。本研究亦發現，FPS也可濃度依賴性抑制OGD/R誘導LDH的釋放。結果提示，FPS可以增強細胞的活力、減少細胞的凋亡，減輕OGD/R對細胞的損傷。

Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子。在正常情況下，Nrf2在細胞質與Keap1蛋白結合處于非活性狀態。氧化應激時，Nrf2與Keap1解離，進入細胞核內與抗氧化反應元件結合，啟動下游靶基因HO-1和其他抗氧化酶如NAD(P)H醌氧化還原酶(NQO1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等［11-13］，從而發揮抗氧化作用［14］;這些作用已經在腦缺血損傷中證實過［15-18］。既往研究表明，激活Nrf2信號通路繼而上調其下游靶蛋白的表達，可以對缺血性腦卒中起到保護作用。Tanaka等［19］的研究發現，MCAO 后再灌注，2 h后Nrf2表達增加并在8 h達到高峰;其下游抗氧化蛋白Trxs、GSH以及HO-1在24～72 h梗死區域的表達亦顯著升高。大鼠MCAO模型中，側腦室或腹腔內注射tBHQ均可降低運動感覺缺損和缺血后的梗死面積［20-21］。與此項研究類似，Nrf2敲除小鼠MCAO后90 min進行再灌注，其神經功能缺損惡化并伴有梗死面積增加［22］。此外，Nrf2基因敲除小鼠的pMCAO模型中，其損傷后7 d的恢復情況亦顯著降低［20］。故活化Nrf2信號通路對缺血性腦卒中后的損傷具有保護作用。在本研究中，我們應用Western blot法檢測了各組細胞胞漿和胞核內Nrf2的表達情況，發現N2a細胞OGD/R后Nrf2及其下游靶蛋白HO-1表達均增加，提示氧化損傷后可以激活Nrf2/ARE通路，起到自身抗氧化作用;同時發現FPS能夠有效促進Nrf2的核轉位，并呈劑量依賴性。因此推測，FPS對腦缺血再灌注的保護作用可能是通過促進Nrf2的表達，降低了腦缺血再灌注時氧化應激的水平。

Nrf2/ARE信號通路可誘導Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶類等多種抗氧化物質的生成。HO-1作為重要的Ⅱ相解毒酶，其通過催化血紅素轉化為等分子量的膽綠素、一氧化碳和游離鐵發揮著強大的抗氧化作用，是反映細胞內抗氧化能力的重要指標。本研究結果提示，不同濃度FPS處理能夠促進HO-1的表達，這亦間接提示Nrf2在腦缺血再灌注中發揮著抗氧化應激作用。

綜上所述，FPS對OGD/R的N2a細胞有劑量依賴性的抗氧化應激作用，其保護機制可能部分是通過促進Nrf2的表達而實現，但其更加詳細的抗氧化應激機制仍需進一步研究。

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