鯊魚再生肝組織差異表達基因的篩選

朱愛萍，吳小華，于曉惠，張 敏，常秀峰，徐清華，焦保權，張 潔

肝臟是動物體內最大的器官，具有十分復雜的功能，包括代謝、合成和儲存功能及調節和維持內部環境穩定等。肝臟再生能力極其強大，肝細胞受損24 h后開始增殖，這期間是由G0期細胞向G1/S轉變，肝部分切除48 h后小血管開始形成，薄壁組織、肝小葉逐漸形成，肝臟逐漸長大并恢復功能［1］。肝部分切除模型［2］的建立推動了肝臟再生機制的研究工作。大量研究結果顯示，肝臟的再生過程受到多種細胞因子和生長因子的調控，包括血管內皮生長因子(VEGF-A)［3］、白介素(IL)-6［4］、肝細胞生長因子(HGF)［5］、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)［6］、轉化生長因子-β(TGF-β)［7］、表皮生長因子(EGF)［8］及肝刺激物質(HSS)［9］等，這些細胞因子和生長因子在動物體內形成了一個復雜的信號傳導和調控網絡，保證機體組織和器官的正常重建并維持其正常生長。鯊魚的肝臟約占內臟重量的75%，許多研究者已從鯊魚體內分離克隆了多種與肝再生和免疫調節相關的刺激因子［10-16］。本研究通過條紋斑竹鯊肝臟2/3部分切除模型建立獲得正常和24 h再生肝組織，利用差別顯示逆轉錄 －聚合酶鏈反應(differential display reverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)技術進行肝再生過程中差異表達基因的篩選，為進一步研究肝再生過程中差異表達的相關功能基因奠定基礎，促進肝病藥物作用新靶點及肝再生機制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 條紋斑竹鯊魚(280 g)，編號4，為中科院南海海洋所海洋生物學實驗室饋贈;無菌注射器、吸收性明膠海綿、非吸收性外科縫線、醫用縫合針、手術剪、手術刀均購自杭州華東醫藥器材公司。

1.2 試劑 麻醉劑:2%水合氯醛溶液，按每公斤鯊魚體重注射15 ml即300 mg水合氯醛配制。大腸桿菌E．coli TG1菌株由本實驗室保存;Taq DNA聚合酶及相應PCR反應試劑購自上海萊楓生物公司;AxyPreTMDNA Gel Extraction Kit購自 AXYGEN公司;pMD?18-T Simple Vector購自 Takara公司;Trizol、Reverse Transcription Reaction(First-Strand cDNA Synthesis)試劑盒購自Promega公司。

1.3 肝臟2/3部分切除模型建立 將4 ml麻醉劑注射鯊魚腹部皮下，2 ～3 min 補加 1 ml［17］，待鯊魚失去運動能力后開始手術。沿腹部中線剪開鯊魚皮膚，切開肌層，切除肝臟右葉2/3部分為正常肝組織，將其迅速放入液氮中冷凍后移至－70℃冰箱保存備用。在創傷處滴加鏈霉素(0．1 g)和青霉素(10萬單位)，縫合肌層和皮膚傷口，將鯊魚繼續飼養24 h后拆除傷口縫線取剩余肝組織的切除邊緣部分為再生肝組織［12］。

1.4 總RNA提取及逆轉錄 采用Trizol法分別提取正常及再生24 h肝組織的total RNA，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計檢測其純度。采用Promega公司逆轉錄試劑盒(First-Strand cDNA Synthesis Reverse Transcription Reaction)進行逆轉錄，反應條件:1250 ng total RNA，RT primer/olig(dT)15 2．5 μl/1．25 μl，70℃ 10 min，迅速冰浴2～5 min;后依次加入MgCl2(25 mmol/L)5．0 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)2．5 μl，10 × RT buffer 2．5 μl，RNase inhibitor 0．625 μl，AMV Reverse Transcriptase 0．625 μl，總反應體系為 25 μl，42℃50 min，95℃ 5 min，立即置于冰上冷卻，－20℃保存備用。

1.5 差異顯示PCR 采用萊楓公司2×Taq PCR Master Mix試劑，將2條錨定引物和20條隨機引物配對形成40種組合對正常和再生24 h肝組織cDNA進行PCR，2種組織共80個PCR反應，引物序列見表1。每個反應體系如下:2×Taq PCR Master Mix 5 μl，錨定引物(50 μmol/L)0．1 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0．5 μl，cDNA 溶液 0．5 μl，ddH2O 3．9 μl，總體積 10 μl。反應程序:95℃5 min;95℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40 個循環;72℃ 10 min。參照《分子克隆》方法配制5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，取PCR產物8μl上樣，電泳100 V，至溴酚藍到達凝膠底部停止;銀染顯色，直至條帶清晰，區分差異電泳條帶。

表1 鯊魚再生肝組織差別顯示逆轉錄－聚合酶鏈反應引物

1.6 差異條帶回收及二次擴增 采用壓碎與浸泡法進行目的片段回收，具體操作如下:將差異條帶切下壓碎后轉移至離心管中，加入150μl 1×TBE，37℃搖床溫浴過夜;離心收集上清，再向原管中加入50μl 1×TBE，37℃搖床溫浴 15 min，離心合并上清;將上清用無水乙醇沉淀過夜，75%乙醇洗滌沉淀，產物溶于10μl ddH2O，－20℃保存備用;以回收的差異基因為模板，以相應錨定引物和相應下游引物進行PCR反應，體系和程序同前;1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，核對條帶大小并割膠回收目的差異條帶。

1.7 目的片段克隆及序列分析 將回收的差異條帶與載體連接，反應條件:Solution I 5μl，目的片段2 μl，pMD?18-T Simple Vector 1 μl，ddH2O 2 μl，總計10μl，16℃連接過夜。將5μl連接產物轉化E．coliTG1感受態細胞，利用載體通用引物菌落PCR鑒定陽性克隆，反應體系:2×Taq PCR Master Mix 5 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0．4 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0．4 μl，總計10 μl;反應程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃1 min，30個循環;72℃ 10 min。序列測定采用正向測序，由上海桑尼公司完成。然后將所得目的差異基因序列與國家生物技術信息中心已表達序列標志(NCBI EST)庫進行Blast比對。

2 結果與分析

2.1 RNA提取 Total RNA用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示5s RNA條帶較暗，28s RNA/18s RNA的比值約為2∶1，可見提取的RNA完整性較高(圖1);用紫外分光光度計檢測總RNA的 OD值，經計算 OD260/OD280的比值為 1．8～2．0，提取的RNA可用于下一步實驗。

圖1 RNA 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測1．正常肝組織;2．再生肝組織

2.2 PCR擴增目的片段 40對PCR產物經5%聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯示，條帶清晰可辨。圖2為6對PCR產物銀染顯示結果，其中有2條差異比較明顯的條帶，表明這2條差異條帶在肝再生過程表達增強。綜合分析，共獲得了10條差異較明顯的序列片段。

2.3 目的片段條帶瓊脂糖凝膠電泳檢測 將選取的10條差異表達的片段用原引物對進行二次PCR擴增鑒定，產物經瓊脂糖凝膠電泳核對條帶，顯示目的差異條帶大小與預期值相符，見圖3。

2.4 差異基因序列分析 10條差異序列通過Blast檢測，其中3條與NCBI EST庫的序列有較高相似性，為已知序列，其他7條序列與已報道基因無同源性，為新發現的功能序列。RF1-6l與33條灰斑竹鯊cDNA克隆序列同源性達到100%，NF2-2與2條貓鯊胚胎 cDNA文庫的序列同源性為80%以上，RF2-6s與狗鯊干細胞系SAE的序列同源性為88%。NF2-2和RF2-6s的比對結果見圖4。10條差異序列的比對及差異表達情況見表2，其中有8條大小為100～500 bp，5條序列在肝再生過程表達上調，另5條表達下調。

圖2 鯊魚再生肝組織差別顯示逆轉錄－聚合酶鏈反應結果M．100bp DNA ladder marker;1 ～12．分別為 NF1-1，RF1-1，NF1-2，RF1-2，NF1-3，RF1-3，NF1-4，RF1-4，NF1-5，RF1-5，NF1-6，RF1-6;N表示正常肝組織，R表示再生肝組織，F1表示錨定引物1，最后的數字編號表示隨機引物編號

圖3 鯊魚再生肝組織差異表達的目的片段瓊脂糖凝膠電泳檢測M．DL2000 DNA分子量標準;1～10．分別為條帶 RF1-6l 534 bp，NF1-19 326 bp，RF1-6s 258 bp，RF2-6s 244 bp，RF2-6l 278 bp，NF1-7 236 bp，RF2-8 283 bp，NF2-19 77 bp，NF1-9 208 bp，NF2-2 173 bp，N表示正常肝組織，R表示再生肝組織，F1表示錨定引物1，F2表示錨定引物2，最后的數字編號表示隨機引物編號

3 討論

mRNA差異顯示PCR技術(differential display PCR，DD-PCR)是由Liang等在1992年建立的一種尋找差異表達基因的方法。真核生物基因的mRNA 3'端多數都帶有一段多聚腺苷酸結構，其有12種組合:5'-NMAAA…AA-3'，其中 N 代表 A、G、C、T 任意一種堿基，M代表G、C、T任意一種堿基。根據此序列特征，按堿基配對的原則，人工合成Poly(dT)引物時在其3'末端加上兩個錨定堿基:5'-TTT…TTTMN-3'(M、N同上)，此引物可將 mRNA反轉錄成cDNA(又稱為第1鏈)，用此引物錨定cDNA第2條鏈3'端，用5'端隨機引物與cDNA第1條鏈互補進行PCR，隨機擴增cDNA片段，將PCR產物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，即可顯示不同的條帶位置，比較不同組間的顯示結果，將差異條帶回收再擴增，通過雜交驗證、克隆測序等，進一步分析其結構與功能［18］。DDRT-PCR技術經過多年的推廣和不斷完善，現已非常成熟，所需RNA量少，操作簡便，靈敏度高，實驗周期短，能同時比較多種樣品，避免了同位素的污染，可以直接從凝膠上切除肉眼可觀察到的條帶，并且能在任何配備了標準分子生物學試劑和儀器的實驗室進行，所以目前大多數研究人員采用DDRT-PCR技術研究功能基因的篩選與克?。?9-21］，但DDRT-PCR操作中有兩個關鍵問題需要注意:一是如何得到穩定、豐富和清晰的差異條帶，二是如何有效地從差異片段中篩選出真正差異表達的片段。

圖4 NF2-2和RF2-6s序列與已表達序列標志庫比對結果A．NF2-2 Blast;B．RF2-6s Blast

表2 鯊魚再生肝組織表達差異序列分析

本實驗采用DDRT-PCR技術進行鯊魚肝臟再生過程中差異表達基因的篩選，應用垂直電泳槽非變性聚丙烯酰胺膠電泳、實驗室常規試劑配制的銀染溶液，能夠取得良好的差異顯示效果，由于所用試劑及配制銀染溶液的水質差別，具體操作中應根據PCR產物的效率對分離上樣量及銀染時間做適當調整，才能得到清晰帶型。本實驗采用2條錨定引物、20條10堿基隨機引物，樣本為正常和再生24 h條紋斑竹鯊肝組織，獲得10條差異片段，其中3條與NCBI EST庫的序列有較高相似性，另外7條為新發現的功能序列片段;5條序列在肝再生過程中表達上調，另5條表達下調，這一結果為進一步研究肝再生相關功能新基因及肝再生機制提供了有效信息。

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