質譜成像技術在實體腫瘤研究中的應用與展望

楊 琳，王 林，宋三泰，劉曉晴

近年來，質譜成像技術取得了巨大進步，一些研究組報道了質譜成像技術在疾病特別是在腫瘤研究中的應用［1-2］。質譜成像技術被用于分析腦腫瘤、肺癌、乳腺癌等腫瘤的分子分布信息，獲取腫瘤特征性分子。此外，質譜成像技術還被用于研究藥物及其代謝物等小分子在腫瘤中的空間分布特征。本文就質譜成像技術在腦腫瘤、肺癌和乳腺癌研究中的應用現狀進行綜述。

1 概述

質譜成像是以質譜技術為基礎的成像方法，該方法通過質譜直接掃描生物樣品成像，可以在同一張組織切片或組織芯片上同時分析數百種分子的空間分布特征［3-5］。質譜成像技術原理為:在低溫環境下，將組織切片黏附于MALDI-MS靶板上，并在組織切片表面噴涂基質，基質與組織切片中的被分析物在原位形成共結晶。隨后，將靶板直接送入質譜儀進行檢測。當激光照射時，共結晶吸收能量而引起被分析物的離子化。質譜儀對被定義的分析區域掃描并采集離子信息。每一個采集點上獲得的信息包括該點的坐標、質荷比以及離子強度的信息。這些信息通過專門的圖像分析軟件轉換處理后，即可獲得該區域各個組分的二維離子分布圖。組分在每個點上的相對量可用亮度強弱或不同顏色來表示［6-8］。該技術無需任何標記，利用分子質荷比區分不同的分子，尋找差異分子。從這些差異分子中發現的組織特異性標志物可用來區分不同組織及同一組織內的不同成分［5，9-11］。

2 質譜成像技術在實體腫瘤研究中的應用

2.1 腦腫瘤 2001年Stoeckli等［11］首次證實質譜成像技術在腫瘤研究中的巨大潛能，該文論述了如何應用質譜成像技術揭示膠質母細胞瘤組織切片的化學空間結構，該研究結果顯示，蛋白胸腺素β4常出現在腫瘤團塊增殖最活躍的部分，而蛋白S100A4則出現在腫瘤團塊的中心。隨后質譜成像技術被證實可直接進行組織分析定位神經膠質瘤，并進行神經膠質瘤的惡性程度分級［12-13］。Chaurand 等［14］論述了如何應用質譜成像技術測定神經膠質瘤中鈣結合蛋白S100B含量水平區以分神經膠質瘤的惡性程度。Schwartz等［12］對人神經膠質瘤組織切片進行質譜成像分析，不但能夠區分腫瘤組織與正常組織，還能將IV型神經膠質瘤同II型、III型有效區分。在IV型中，S100B(m/z 10 836)蛋白呈明顯高表達，這與免疫組化驗證實驗的結果完全一致。3D質譜成像［15］及 3D 質譜成像同步聯合 MRI［11，16］也被應用于腦腫瘤的研究。有研究表明星形細胞磷蛋白Pea15在Ⅲ神經膠質瘤中的水平升高［17］，MRI圖像與3D質譜成像均能很好的顯示星形細胞磷蛋白Pea15在神經膠質瘤中的空間分布。Sinha等［16］的研究顯示，通過對比星形細胞磷蛋白Pea15 3D質譜圖像的2D投影圖像與不同序列的MRI圖像(包括T1加權像、T2加權像、彌散像及脂肪抑制像)以及膠質瘤與瘤旁正常組織的感興趣區域分析結果，可以看出3D質譜成像區分膠質瘤的能力同MRI一樣出色。MRI圖像可以顯示膠質瘤與正常腦組織間的細胞密度、水及蛋白差異;質譜成像技術則能詮釋MRI顯示的解剖學結構特征的分子表型，并且能評估這些分子表型的改變是否與腫瘤生長的解剖學改變一致［7］。

質譜成像同樣被應用于在腦腫瘤組織中直接分析藥物及其代謝物等小分子的空間分布信息［18-19］。近年來，質譜成像在小分子領域的應用還被開發用來檢測MRI增強劑的組織分布，并用電感耦合等離子體原子發射光譜方法對實驗結果進行驗證［20］。靶向MRI增強劑是早期發現疾病標志物的關鍵工具之一，質譜成像技術能獨立提供增強劑的空間分布信息，借此可明確與增強劑結合的靶向性標志物的空間分布特征。

2.2 肺癌 Groseclose等［10］應用質譜成像技術對包含112例針吸活檢標本的小型肺癌組織芯片進行了研究。首先，由一位病理學家在光鏡下對該組織芯片的HE染色切片進行分析，劃分每一例活檢標本的癌區、癌旁區和正常組織區。隨后，來自相同活檢標本的未經病理標注組織芯片與病理標注組織芯片的HE染色切片進行匹配比對，劃定未經病理標注組織芯片的癌區、非癌區范圍，最后用未經標注的組織芯片進行組織溶解質譜成像。進行質譜成像的組織芯片上，一部分針吸活檢組織作為訓練組，并用病理學家的診斷對訓練組針吸活檢組織的質譜信號進行標注，建立分類模型。這個包含73個胰蛋白酶肽峰的基于支持矢量機的分類模型對腺癌的識別準確率為97.9%，對鱗癌的識別準確率為98.6%。

張瑩等［21］采用質譜成像技術對非小細胞肺癌患者的癌組織和癌旁組織分別進行正離子反射模式和線性模式質譜掃描，發現癌組織在m/z 3000～3500范圍內有特征簇峰出現。Marko Varga等［22］應用質譜成像成功區分慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)合并肺癌患者肺內癌組織和非癌組織，并明確了異丙托銨在COPD合并肺癌患者肺內的分布情況。Harris等［23］應用質譜成像技術明確了酰基輔酶A結合蛋白在原位及浸潤性非小細胞肺癌組織中的分布，該研究顯示酰基輔酶A結合蛋白在原位及浸潤性非小細胞肺癌中過表達，高表達該蛋白的患者預后差。

近年來，質譜成像還被應用于肺癌治療藥物酪氨酸酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)——吉非替尼和厄羅替尼的研究。Marko Varga等［24］采用壓電配藥方法使TKI沉積在肺癌組織表面，并對分布于肺癌組織表面的TKI進行質譜成像，以期應用肺鱗癌、腺癌、大細胞癌3種不同的非小細胞亞型建立新的TKI藥物代謝動力學模型。研究發現，不論肺癌的病理類型與藥物種類為哪一類，間質區的藥物信號均較腫瘤區更強。Signor等［25］選用鼠為模型，口服厄羅替尼，劑量5 mg/kg，應用質譜成像研究厄羅替尼及其代謝物在肝臟、脾、肌肉組織中的分布，結果顯示厄羅替尼在肝中濃度最高，且在肝中發現了厄羅替尼的代謝物，表明厄羅替尼是在肝中進行代謝的。

2.3 乳腺癌 雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)狀態與乳腺癌的診斷及治療密切相關。近年來，有研究表明，對上述3種蛋白mRNA的多重檢測能大幅提升乳腺癌的診斷水平，并指導乳腺癌的個體化治療［26］。Rauser等［27］證實質譜成像能直接從患者乳腺癌組織明確其HER2狀態。對48例乳腺癌組織的質譜成像分析顯示HER2狀態與特異性多肽/蛋白的表達改變相關，這些多肽/蛋白的表達改變能區分癌組織與正常組織，其敏感性達83%，特異性達92%，總體準確率達89%。富含半胱氨酸的小腸蛋白1被認為是與HER2過表達密切相關的蛋白之一，并被證實應用該蛋白的質譜圖像可以建立乳腺癌診斷的新方法。Reyzer等［28］對HER2轉基因鼠進行質譜分析，發現了一組能預測分子靶向治療效果的蛋白，研究結果顯示用HER2受體抑制劑Herceptin對患乳腺癌的老鼠進行治療，當胸腺素β4和泛素下降超過80%時，癌組織出現癌細胞增殖抑制、誘導凋亡及體積減小。同時該研究組應用質譜成像技術證實，這兩種蛋白在老鼠體內的分布與抑制劑的分布基本一致，且該預測作用具有時間依賴性和劑量依賴性。質譜成像還被用于分析乳腺癌蛋白表達的異質性［1-2］。Seeley 等［1］的研究表明，同一張乳腺癌組織切片的不同區域會產生不同的蛋白質譜圖像，這表明腫瘤中不同種類蛋白質有其特定的空間分布特征，且與正常組織蛋白質的空間分布不同。該研究的對象為發生乳腺癌轉移淋巴結，m/z 11 307的蛋白在癌組織和和正常淋巴組織中均有分布，m/z 9004的蛋白僅分布在癌組織浸潤最活躍的部位，m/z 5358的蛋白則僅分布于正常組織。Seeley等［2］的另一項研究證實了3種蛋白在乳腺癌組織中的空間分布確有不同:組蛋白H2A集中分布于乳腺導管癌原發部位，calgizzarin主要分布于乳腺導管癌浸潤區，而胸腺素β4則集中分布于乳腺導管癌間質中。Dekker等［29］應用質譜成像方法比較乳腺癌患者腫瘤內、外間質區的信號差異，發現了與腫瘤間質活化密切相關的4個蛋白信號，其中一個蛋白信號被確認為PA28。Kang等［30］應用質譜成像串聯質譜技術對乳腺癌組織進行研究，發現免疫球蛋白重鏈A2是乳腺癌微環境的區域特異性蛋白，該蛋白的表達與乳腺癌淋巴結轉移密切相關，表達該蛋白的淋巴結發生轉移的風險提升了3.745倍。

質譜成像技術同樣被用于組織溶解福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)乳腺癌組織的成像。Ronci等［31］在組織溶解FFPE乳腺癌組織質譜成像研究中探討了FFPE組織分析的諸多復雜因素，論述了利用原位溶解增加檢測到和識別的蛋白質數量的方法，并應用原位溶解質譜成像發現了一組能夠準確區分乳腺癌組織和正常組織的胰蛋白酶肽。

質譜成像技術也被用于已知蛋白的靶向性成像。Seuma等［32］利用Au/Ag標記抗體技術及定量元素成像-激光消融電感耦聯血漿質譜對已知的備選標志物進行定量成像，證實該方法具有良好的可重復性和定量特性。應用這種已知蛋白靶向性成像研究方法可對近年來發現的大量血清/血漿蛋白譜研究結果進行進一步分析。Callesen等［33］在其發表的一篇應用質譜技術找尋乳腺癌診斷標志物可重復性的綜述中認為，盡管各研究的實驗設計、實驗條件、數據分析方法及分析的可重復性存在差異，但從這些研究中足以找出一組具有良好可重復性的乳腺癌診斷差異蛋白，應用乳腺癌組織芯片的抗體標記靶向性成像方法就可驗證這些待確證蛋白是否為乳腺癌診斷差異蛋白。

質譜成像在乳腺癌脂類分子的研究中也有應用。Chughtai等［34］將 MDA-MB-231細胞注射進無胸腺裸鼠體內，待瘤荷達500 mm2時處死裸鼠，應用離子遷移質譜陽離子模式進行質譜成像，明確腫瘤內酰基肉毒堿、鞘磷脂類、甘油磷脂酰膽堿等脂類分布信息。質譜成像的定量研究特性顯示，腫瘤組強酰基肉毒堿、鞘磷脂類、甘油磷脂酰膽堿較正常組織存在數量差異。這項關于乳腺癌微環境的脂類組成的研究證實，乳腺癌的脂類組成與乳腺癌的轉移密切相關。Kawashima等［35］對9例乳腺癌患者的癌組織和1例正常人乳腺組織進行質譜成像分析，發現了10種由異常脂肪酸組成的磷脂酰肌醇脂類，該組脂類在乳腺癌組織惡性上皮區的分布并不一致，能夠區分上皮區的癌組織和周圍間質組織。該研究還發現高表達磷脂酰肌醇(18∶0/20∶3)的乳腺癌組織更具侵襲性。Ide等［36］對29例乳腺癌組織進行質譜成像分析，以了解磷脂酰膽堿脂類和溶血磷脂膽堿脂類在乳腺癌組織中的空間分布，結果顯示4 種磷脂酰膽堿(32∶1、34∶1、36∶1、34∶0)僅分布在癌組織區，溶血磷脂膽堿脂類在癌區和非癌區的分布并無差異，磷脂酰膽堿(36∶1)∶磷脂酰膽堿(36∶0)的比率和磷脂酰膽堿(36∶1)∶溶血磷脂膽堿(18∶0)的比率在癌區相對于非癌區高。

3 小結

質譜成像技術在腫瘤組織的識別、腫瘤亞型及惡性程度的區分、良惡性腫瘤的鑒別以及腫瘤藥物的研究等多個腫瘤研究領域廣泛應用，究其原因在于其可以非靶向性地同時研究多種分子的空間分布特征。除多肽/蛋白質外，質譜成像可用于其他多種類型分子的研究，如脂類［37］、代謝物［38］等，只是樣本準備方法不同。此外，質譜成像還具備與其他已經建立的體內、體外研究方法聯合應用的潛能。目前，質譜成像組織分類均是以組織學分析為基礎［8，39-40］。經組織學標記過的組織切片質譜信號被用來創建分類模型，隨后用其他切片對該分類模型進行驗證。質譜成像可進行組織學類型分類，證明其可被用于臨床，并有可能成為新的診斷/預后工具，但要驗證質譜成像的這些潛能，還需要進行大樣本的實驗研究，特別是針對臨床人群的研究［39］。同時，質譜成像技術又獨立于組織學分析，因此能在病理性實體出現前就檢測到生化改變，基于質譜成像技術的對備選蛋白標志物的識別已得到部分研究證實［41-42］。未來基于組織芯片同步分析的分類方法將成為質譜成像發現標志物的主要發展方向，這種高通量研究方法將會使近來備受關注的高速基質輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)質譜和自動質譜成像得到發展［43］。

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