不同葡萄糖培養(yǎng)濃度對健康成人外周血白細胞G6PD活性及呼吸爆發(fā)功能的影響

曾慧妍，曹 瑛，薛耀明△

（1．廣東省中醫(yī)院內分泌科，廣州510120；2．南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院內分泌及代謝病科，廣州510000）

糖尿病患者存在易感染的特點，既往研究顯示這與白細胞功能受損密不可分［1-2］。外周血白細胞是固有免疫系統(tǒng)的主要組成部分，其殺菌能力在抵御外界微生物侵襲方面發(fā)揮著至關重要的作用。白細胞殺滅細菌的主要手段為呼吸爆發(fā)。因此，呼吸爆發(fā)功能正常與否決定了白細胞是否能有效實現(xiàn)機體免疫，減少感染發(fā)生。同時，呼吸爆發(fā)功能與糖代謝存在密切聯(lián)系。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）作為戊糖磷酸途徑的關鍵酶，為呼吸爆發(fā)提供必需物質——還原型輔酶Ⅱ（NADPH）。因此，G6PD活性直接關系到呼吸爆發(fā)功能的正常發(fā)揮。作者的前期研究已發(fā)現(xiàn)，與健康成人相比，2型糖尿病患者外周血白細胞G6PD活性及細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平均明顯降低，存在明顯的白細胞呼吸爆發(fā)功能障礙［3］。那么，正常人外周血白細胞在高濃度葡萄糖培養(yǎng)環(huán)境下是否也會和糖尿病患者一樣出現(xiàn)白細胞呼吸爆發(fā)功能障礙呢？白細胞呼吸爆發(fā)改變是否與葡萄糖培養(yǎng)濃度有關？本實驗擬以健康成人外周血離體白細胞為研究對象，探討高糖環(huán)境培養(yǎng)濃度與健康成人白細胞G6PD活性及呼吸爆發(fā)功能之間的關系，為進一步研究糖尿病患者易感染的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集健康成人外周血標本24例，其中，男14例，女10例，平均年齡（25．0±1．3）歲，為南方醫(yī)院和廣東省中醫(yī)院健康體檢者。無糖尿病家族史、無G6PD缺乏癥家族史。無冠心病、肝腎功能不全等慢性病史。無惡性腫瘤、結締組織病、器官移植術后、白血病等需使用細胞毒制劑和非選擇性免疫抑制劑的病史。近期無服藥史。白細胞計數(shù)在正常范圍（4～10）×109／L；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibcol公司；胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS）購自Hyclone公司；G6PD活性檢測試劑盒購自中山生物工程有限公司；ROS檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) 收集健康成人外周血標本（EDTA抗凝）后，使用紅細胞裂解液進行外周血白細胞的分離，離心后取管底白色沉淀，加入含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕輕吹打使其徹底混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加青霉素、鏈霉素為1×105U／L。

1．2．2 實驗分組 根據(jù)實驗需要隨機分為4組：5 mmol／L組（5 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）、15 mmol／L組（15 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）、25 mmol／L組（25 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）、高滲對照組（L-GLU組，20 mmol／L L-葡萄糖＋5 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）。培養(yǎng)8 h后，每組分別取樣本檢測G6PD活性及ROS產(chǎn)量。

1．3 檢測指標 四氮唑藍定量測定法檢測G6PD活性、熒光探針法檢測細胞內ROS產(chǎn)量，操作均按照相關試劑盒說明書進行。各組細胞裝載DCFH-DA熒光探針后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。每例樣本隨機抽取30個細胞，用Leica專用圖像分析處理軟件，對細胞內熒光密度進行分析。

1．4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量的比較 5 mmol／L組與LGLU組的G6PD活性及ROS產(chǎn)量均無明顯差異（均P＞0．05）。與5 mmol／L組相比，15 mmol／L組及25 mmol／L組均出現(xiàn)不同程度的G6PD活性降低及ROS產(chǎn)量減少，且25 mmol／L組G6PD活性及ROS產(chǎn)量均顯著低于15 mmol／L組（F＝9．095，P＜0．001），見表1。

2．2 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量變化 4組ROS熒光激光共聚焦顯微鏡下觀察培養(yǎng)8 h后，5 mmol／L組及L-GLU組細胞內熒光無明顯改變，保持中等強度熒光，多數(shù)細胞可見細胞核，部分細胞可見高強度熒光。15 mmol／L組及25 mmol／L組細胞內均出現(xiàn)熒光分布不均，熒光強度弱，個別細胞肉眼難以辨認細胞外形（圖1）。

表1 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量變化（±s）

表1 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量變化（±s）

＊：P＜0．01，與5 mmol／L組比較；＃：P＜0．01，與15 mmol／L組比較。

組別 G6PD活性 ROS 產(chǎn)量5 mmol／L組1．37±0．14 196．73±19．79 15 mmol／L組 0．98±0．13＊ 130．30±17．59＊25 mmol／L組 0．73±0．09＊＃ 106．48±18．09＊＃L-GL U組 1．32±0．11 197．68±19．34 F 53．601 1 111．634 P 0．000 0．000

圖1 各組ROS熒光變化

2．3 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量與葡萄糖培養(yǎng)濃度的相關性分析 培養(yǎng)8 h后，5 mmol／L組、15 mmol／L組及25 mmol／L組G6PD活性逐漸降低，ROS產(chǎn)量亦隨之減少，G6PD活性、ROS產(chǎn)量分別與葡萄糖培養(yǎng)濃度呈負相關（r＝-0．916，P＜0．001；r＝-0．951，P＜0．001）。而L-GLU組ROS產(chǎn)量及G6PD活性與葡萄糖濃度之間無相關性。

3 討 論

糖尿病患者易感染部分歸咎于白細胞的吞噬殺菌作用降低。吞噬細胞的吞噬殺菌作用降低是糖尿病患者免疫功能紊亂的主要表現(xiàn)之一，這為細菌的侵入及繁殖創(chuàng)造了有利條件。大量研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血中的中性粒細胞的黏附、趨化、吞噬和殺菌能力均顯著低于正常對照組，提示其易感染性與白細胞功能有一定的關系［4-5］。有學者將糖尿病患者外周血白細胞與葡萄糖和胰島素一起培養(yǎng)可恢復其趨化性，提示其功能與糖代謝有關。血糖控制不良的糖尿病患者，其白細胞殺菌能力明顯低于血糖控制良好者，提示白細胞內的殺菌能力與血糖控制程度有關。但高血糖改變白細胞功能的具體機制尚未有明確答案，目前關于該方面的國內外研究甚少。既往有學者研究發(fā)現(xiàn)，與健康成人相比，糖尿病患者中性粒細胞的吞噬能力明顯下降且與血糖呈負相關關系，高糖環(huán)境是導致白細胞吞噬功能降低的重要因素［6］。

呼吸爆發(fā)是白細胞激活后行使殺菌功能的主要途徑。當白細胞被激活后，能產(chǎn)生大量的ROS，并通過ROS殺死入侵的微生物和病原體。由于在這個過程中，白細胞的耗氧量急劇上升，甚至可達正常量的2～20倍，葡萄糖的代謝活動也明顯增加，故將該現(xiàn)象稱為“呼吸爆發(fā)”。NADPH作為呼吸爆發(fā)反應的惟一供氫體，是呼吸爆發(fā)的必需物質，其產(chǎn)量直接影響ROS的產(chǎn)生。而NADPH的生成僅僅來源于細胞內磷酸戊糖途徑。因此，G6PD作為磷酸戊糖途徑的限速酶，其活性對于呼吸爆發(fā)的正常發(fā)揮就顯得尤為重要。前期研究發(fā)現(xiàn)，與健康成人比較，2型糖尿病患者存在明顯的白細胞功能障礙，該結果與既往研究結果相符［4］。在本研究中，通過離體外周血白細胞培養(yǎng)再次驗證了高糖培養(yǎng)環(huán)境對白細胞呼吸爆發(fā)功能的影響。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)8 h后，15 mmol／L組和25 mmol／L組均出現(xiàn)G6PD活性及ROS產(chǎn)量顯著下降，而5 mmol／L組無明顯改變，L-GLU組用20 mmol／L的L-葡萄糖＋5 mmol／L的D-葡萄糖聯(lián)合培養(yǎng)細胞作為高滲對照則排除了滲透壓引起各指標的改變。該結果進一步證實了上述葡萄糖濃度增高可導致白細胞呼吸爆發(fā)功能降低的觀點。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度的升高，健康成人白細胞的G6PD活性減弱，ROS釋放量也隨之下降且G6PD活性、ROS產(chǎn)量分別與培養(yǎng)基葡萄糖濃度呈負相關，提示細胞吞噬殺菌功能與其所處環(huán)境有關，高糖環(huán)境對離體培養(yǎng)的白細胞是一個刺激因素，糖濃度越高刺激強度越大。因此，推測高糖環(huán)境中G6PD活性降低導致細胞吞噬殺菌功能低下可能是糖尿病患者易于感染的主要原因之一。目前對兩者關系的研究較少，國外僅Alba-Loureiro等［7］對此進行了研究，發(fā)現(xiàn)糖尿病可導致小鼠白細胞代謝與功能的明顯改變，與正常小鼠相比，糖尿病小鼠的中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞G6PD活性均明顯降低，提出白細胞G6PD缺乏可導致吞噬功能障礙、殺菌能力下降及過氧化物生成減少的觀點，這與Moutschen［8］的觀點一致。國內暫未發(fā)現(xiàn)類似的研究報道。本研究通過人離體細胞培養(yǎng)，對葡萄糖培養(yǎng)濃度、白細胞G6PD活性及呼吸爆發(fā)功能三者的內在聯(lián)系進行了探討，其結果與上述國外的研究結果相符［7-8］。

結合作者的前期研究，本研究從人離體細胞培養(yǎng)和臨床研究兩個層面對糖尿病血糖控制水平、白細胞G6PD活性及呼吸爆發(fā)功能三者的內在聯(lián)系進行了初步探討。然而，高糖是否單純通過抑制G6PD活性來抑制白細胞呼吸爆發(fā)功能？是否還通過其他機制來抑制白細胞呼吸爆發(fā)呢？高糖導致G6PD活性降低的機制是什么？有待進一步的研究。

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［3］曾慧妍，曹瑛，薛耀明，等．糖尿病患者外周血白細胞PPP途徑代謝與呼吸爆發(fā)關系的初步研究［J］．廣東醫(yī)學，2012，33（8）：1136-1138．

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［7］Alba-Loureiro TC，Hirabara SM，Mendonca JR，et al．Diabetes causes marked changes in function and metabolismof rat neutrophils［J］．J Endocrinol，2006，188：295-303．

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