微小RNA鼻咽癌潛在的診斷標志和治療靶點

龍表利綜述，胡國華審校

（1．重慶市大足區人民醫院耳鼻喉科 402360；2．重慶醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科 400016）

鼻咽癌主要為非角化鱗狀細胞癌，其惡性程度很高，伴隨著局部浸潤和早期遠處轉移。鼻咽癌的病因主要包括3個方面，即遺傳易感性、環境因素和EB病毒（EBV）感染，然而，鼻咽癌發病的分子機制仍未完全明確。鼻咽癌對放化療非常敏感，如果腫瘤僅局限于鼻咽部，可以通過放療治愈。遺憾的是，30%～40%確診的患者已經到了晚期，他們往往在治療4年后出現遠處轉移或局部復發。因此，迫切需要更深入地研究鼻咽癌的分子機制，尋找早期診斷和預后的生物標志物及開發新的治療方案。

從體液中檢測生物學標志物的方法叫做“體液活檢”。最近，這種方法被高度重視，因為細胞內自由核酸類物質DNA、mRNA和微小RNA（mi RNA）作為血液中生物學標志物具有潛在的價值。這些天然的內源性小RNA分子可以下調或抑制mRNA的表達，在很多生物學進程中發揮重要的作用，如腫瘤的發生、發展。他們可能不僅是潛在的生物標志物，還是克服耐藥性和腫瘤復發的藥物靶點。本文主要從mi RNA與鼻咽癌、mi RNA作為診斷和預后的生物學標志物及mi RNA作為鼻咽癌的治療靶點3個方面進行了綜述。

1 mi RNA與鼻咽癌

1．1 mi RNA mi RNA是一類內源性非編碼RNA分子，長度為22個核苷酸，新近發現在所有真核生物中起轉錄后調控作用。早在1993年，mi RNA在新桿狀線蟲lin-4類中首次被發現［1］。Lin-4編碼小RNA，通過反義RNA之間相互作用調節lin-14翻譯。最初，人們認為lin-4僅在蛔蟲中存在，并沒有得到廣泛的關注。直到2001年，3個研究團隊同時報道了他們關于mi RNA作為基因沉默調節器的研究［2-4］。之后，這些mi RNA受到極大的關注。目前，在所有多細胞真核生物、一些單細胞真核生物甚至一些非細胞生物（如病毒）中都已明確有mi RNA的存在。研究發現mi RNA在高等生物中是RNA調節器中最重要的一類。基于生物信息學分析，在多細胞真核生物中，mi RNA調節超過60%的基因。

一個成熟的mi RNA作為反式作用因子調節大多數基因，徹底改變了人們對基因調控網絡的看法。據統計，大約50%mi RNA定位在易碎的染色體區，在腫瘤發生、發展中，這些染色體區域可能會出現DNA擴增、缺失和易位。另一個重大的發現是在2004年成功鑒定病毒編碼的mi RNA（病毒mi RNA，v mi RNA）［5］。腫瘤相關v mi RNA在腫瘤發生、發展中起了重要作用。

1．2 mi RNA在鼻咽癌中的機制 眾所周知，鼻咽癌的發病機制是一個非常復雜的過程，有許多重要的分子和相應的信號通路參與。研究證實EBV潛伏膜蛋白、Wnt／β-catenin通路的分子、生長因子和細胞外基質參與調節MAPK／ERK信號通路，在鼻咽癌發生、細胞增殖和轉移的所有步驟中mi RNA起了一個關鍵的作用。許多科學家致力于發現mi RNA在鼻咽癌發展中的功能。Mi R-200a靶基因ZEB2和β-catenin不僅抑制鼻咽癌細胞的生長、遷移和侵襲，而且有助于上皮細胞間質向干細胞的過度，這是致癌作用的關鍵步驟［6］。c-Myc是細胞癌變的關鍵因子，研究表明c-Myc調節一系列mi RNA且被mi RNA調 節，如mi R-34b、-34c、-18a、-29a／b、-100、-141、-221和let-7家族成員。mi RNA功能失調導致一些其他重要分子的異常，如EZH2，一個多硫蛋白基因產物，調節組蛋白3的甲基化［7-8］；Plk1，調節G2／M期過渡的激酶；ROBO1，血管生成受體和調節子；Cox-2，前列腺素合成的限速酶。所有這些蛋白質在發病機理、轉移和預后差等方面起了重要作用。兩大實驗室同時證明了mi RNA（mi R-26a，-98、-101）失調導致EZH2致癌基因過表達、細胞增殖、腫瘤形成和抑制細胞分化。在鼻咽癌中，降低mi R-26a表達能夠激活c-myc、細胞周期蛋白D3和E2、細胞周期依賴激酶CDK4和CDK6，抑制CDK抑制劑p14、ARF、p21、CIP1的表達［7-8］。mi R-100下調導致Plk1過表達。通過mi RNA使Plk1表達沉默導致細胞有絲分裂顯著增強［9］。抑制mi R-26b導致COX-2蛋白在去鐵敏（解毒藥，DFOM）處理的鼻咽癌細胞中表達上調。Mi R-10b在EBV陽性的C666-1／L MP鼻咽癌細胞中上調。相反的，在L MP1陰性的C666-1細胞過表達mi R-10使鼻咽癌細胞侵襲性增強并導致荷瘤裸鼠死亡。下調mi R-218，導致SLIT表觀遺傳學沉默，細胞凋亡蛋白BIRC5在鼻咽癌細胞中過表達。Mi R-28通過下調SLIT2-ROBO1通路抑制鼻咽癌進展。

2 mi RNA作為診斷和預后的標志物

2．1 EBV編碼的v mi RNA EBV基因組總共有25個EBV mi RNA前體和44個成熟v mi RNA，對應BHRF1區（4個mi RNA）和BART區（40個mi RNA）。研究表明在鼻咽癌中BHRF1區無mi RNA表達，然而，BART mi RNA調節病毒和宿主靶點使其潛伏感染更容易，同時誘發致癌信號。

至今，在鼻咽癌中只有少數EBV mi RNA功能和作用靶點已經明確。據文獻報道，已有3個EBV mi RNA，（mi RBART1-5p、mi R-BART16和mi RBART17-5p）引起EBV蛋白L MP1下調［10］。L MP1調節核轉錄因子-κB（NF-κB）信號從而控制宿主細胞的生長和凋亡，通過mi R-BART5下調宿主細胞基因PUMA抑制病毒感染的宿主細胞凋亡［11］。Mi R-BART2靶向作用于EBV DNA聚合酶BALF5，可能在細胞溶解到潛伏感染的過渡期通過延緩病毒的復制促進病毒進入潛伏期［12］。通過mi R-BART2使L MP2 A表達下調，有可能允許EBV感染的鼻咽癌細胞逃離宿主的免疫監督［13］。mi RBHRF1-3抑制干擾素誘導CXCL11，可阻斷EBV從T細胞感染B細胞。然而下調應急誘導的自然殺傷（NK）細胞如MICB，mi R-BART2-5p導致病毒從識別和消除的NK細胞中逃逸［14-15］。Wong等［16］報道，通過mi RNA調節宿主與病毒相互作用機制，揭示mi RNA涉及到鼻咽癌的發病機制，而且對臨床運用“體液活檢”篩選生物學標志物具有巨大潛力，因為宿主血清v mi RNA與EBV v mi RNA有明確的相關性。EBV編碼的mi RNA見表1。

表1 鼻咽癌中EBV編碼的mi RNA

2．2 人類宿主編碼的mi RNA 實時調查原始致癌EBV和宿主細胞相互作用并揭示病毒與細胞的監管動態比較困難。然而，仍然可以在臨床樣本中檢測到mi RNA，在體內外試驗中研究他們的功能。

最近，人們嘗試各種各樣的方法在臨床鼻咽癌標本中發現人類mi RNA及與TNM分期的聯系。2008年，Sengupta等［17］運用激光顯微切割成對的鼻咽癌組織（腫瘤組織和癌旁組織）揭示了mi RNA表達譜。他們發現8個（共207）mi RNA較明顯的表達改變，進一步研究mi R-29c的功能顯示這個宿主mi RNA（h mi RNA）通過細胞外基質蛋白參與了鼻咽癌細胞的侵襲和轉移。后來，用PCR mi RNo mes研究，鼻咽癌細胞中35個（共270）h mi RNA有顯著的改變［18］。最近，34個h mi RNA的表達改變通過組織芯片研究，且與鼻咽癌臨床分期相關。引人注目的是，神經系統和感官知覺的發育與鼻咽癌相關［19］。從5對鼻咽癌組織和癌旁組織mi RNo mes中，Wong等［16］利用一個大規模的陣列（包含850個宿主mi RNA和39個EBV病毒mi RNA）研究宿主病毒相互作用。

2．3 細胞自由mi RNA 除了大多數人們關注的細胞內mi RNA，最近在EBV陽性的細胞外基質中發現一些mi RNA。這些循環mi RNA能夠進一步參與和抑制周圍細胞和臨近受體細胞的功能［20］。Rechavi等［21］報道稱，當EBV編碼的mi RNA與B細胞共培養，B細胞向非EBV感染的T細胞轉化。更重要的是，他們發現mi RNA在受體T細胞中使目標基因表達沉默。另外一個研究顯示在多個鼻咽癌細胞中（如C15、C17和C666-1），BART mi RNA-1（mi R-1-5p和5）和BART mi RNA-2（mi R-7-3p、12和13）被釋放到細胞外基質中；此外，BART mi RNA在鼻咽癌裸鼠和鼻咽癌患者血清中均能檢測到［22］。Meckes等［23］不僅檢測到鼻咽癌細胞分泌BART-mi RNA，而且鑒定了病毒腫瘤蛋白L MP1作為分泌BART-mi RNA的信使。在這項研究中，進一步評估L MP1在調節外分泌體（如BART-mi RNA）中的作用，L MP1增加表皮生長因子受體的釋放，導致細胞外調節蛋白激酶（ERK）和PI3 K／Akt信號通路的活化。近日，在血清中檢測到EBV編碼的cf mi RNA［16］。研究人員首次運用微陣列技術分析5對鼻咽癌組織芯片v mi RNA的表達差異，用實時定量PCR技術證實了表達上調的v mi RNA有12個（BART1-3p、2-5p、5、6-5p、6-3p、7、8、9、14、17-5p、18-5p、19-3p）。他們發現鼻咽癌患者血清中的v mi RNA與鼻咽癌細胞中的v mi RNA在數量上有明確的相關性。從生物信息學角度進一步分析結果提示BART v mi RNA是許多信號通路的靶分子。顯然，v mi RNA參與PTEN（PI3 K／AKT通路）和Wnt信號通路（表1），包括抑癌基因如WIF1、NKD、CXXC4和APC（關鍵的Wnt抑制分子）和一些其他的信號分子如Wnt級聯信號（ERK信號的NLK和調節泛素水解的BTRCP）相互調節［16］。

3 mi RNA基因治療

攜帶mi RNA的慢病毒可用于鼻咽癌的基因治療。2009年，Li等［24］用慢病毒表達mi R-155使環氧合酶-2（cox-2）在鼻咽癌細胞C666-1中表達沉默。他們研究表明Lenti-mi R-155可能會是一個更好的cox-2抑制劑。Qu等［25］通過研究mi R-155導致無線電電阻錳超氧化物歧化酶（SOD2）的沉默是否減少鼻咽癌抗電離輻射，結果表明mi R-155在CNE1細胞過表達，65%SOD2 mRNA和80%蛋白質下調，克隆形成減少（從24．5%減少到9．67%），提示mi R-155可能會提高鼻咽癌放療效率。而Lenti-mi R-26a顯著抑制鼻咽癌細胞在裸鼠體內成瘤能力，提示了一個潛在的治療價值［7］。

4 結論與展望

mi RNA在鼻咽癌中各種生物功能的研究為人們提供了很有價值的信息，揭露了EBV相關性鼻咽癌發生的潛在機制。EBV利用他的v mi RNA通過推遲復制周期使其更容易在體內潛伏（如通過BART 2-5p失去對BALF5的調節功能）和逃避NK細胞（如MICB）。一旦EBV成功定居于易感的上皮細胞，病毒侵襲性感染逐漸變得活躍起來，漸漸開始有選擇性地表達其癌基因和幾個致癌mi RNAs，如L MP1／2和BART mi RNA在幾個通路中關鍵調節分子信號轉換過程中相互交流如βcatenin、NF-κB、ERK、c-myc。致癌作用經過多步驟積累，鼻咽上皮細胞逐漸發展為一個腫瘤微環境，伴隨異常基因表達，增殖不受控制（如Pl K1、cyclin D和E）和抗細胞凋亡（如PUMA）。EBV甚至可以釋放致癌物質，這些物質攜帶超負荷的病毒和細胞產物（如L MP1、v mi RNA和EGFR）到體液中形成一個易于腫瘤轉移和侵襲的環境（如MMPs、Cox-2、ROBO1和ECM）。

通過micro RNA增進宿主與病毒之間相互交流作用，如h mi RNA和v mi RNA，為鼻咽癌腫瘤形成提供可能的潛在機制。hmi RNA和v mi RNA的大量研究，不僅可以作為潛在的生物學標志物用于篩查高危人群，而且可以成為鼻咽癌治療靶點，增加鼻咽癌放化療敏感性，降低復發和耐藥性。

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