纈沙坦對血管平滑肌細胞增殖、遷移及p-ERK1／2、p-P38表達的影響

陳宗建，張延斌

（江蘇省昆山市第二人民醫院，江蘇昆山215300）

冠心病是威脅人類身體健康的一類重大疾病。經皮冠狀動脈介入治療（PCI）是目前冠心病介入治療的重要方法，主要包括經皮腔內冠狀動脈成形術和支架植入術［1］。但是，PCI術后的近期效果理想，而遠期效果并不理想，術后再狹窄是人類面臨的又一難題。血管平滑肌細胞（vascular s mooth muscle cell，VSMCs）的異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化和血管成形術后再狹窄的主要病理基礎［2］。研究發現，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）與支架術后再狹窄的發展過程密切相關，AT1受體的激活可促進VSMCs的增殖與遷移，故ARB（常用高血壓一線治療藥）可能會降低支架植入后的再狹窄率。目前，AngⅡ通過p-ERK1／2促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活促進VSMCs增殖與遷移的機制已被證實［3］，但纈沙坦（Val）對AngⅡ誘導VSMCs增殖與遷移的影響以及與p-ERK1／2、p-P38 MAPK表達關系的研究并不多。

本研究觀察了Val對AngⅡ刺激下離體大鼠胸主動脈VSMCs的增殖與遷移及p-ERK1／2、p-P38 MAPK表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1．1 主要材料與試劑 Sprague-Dawley大鼠，雄性，體質量150～200 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供；Val（常州四藥有限公司惠贈），AngⅡ（Sig ma，美國），PD98059（ERK1／2上游激酶的特異性抑制劑）（Sigma，美國），SB23015（P38上游激酶的特異性抑制劑）（Sig ma，美國），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物材料有限公司），DMEM培養基（Gibco，美國）；噻唑藍（MTT）（Sig ma，美國），兔抗鼠ERK1／2、p-ERK1／2-抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，美國原裝進口分裝），兔抗鼠P38、p-P38-抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，美國原裝進口分裝）。

1．2 VSMCs的培養與鑒定 取雄性Sprague-Dawley大鼠1只，10%水合氯醛2 mL腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min。移入超凈工作臺，解剖分離出大鼠心肺組織與胸主動脈，剪下胸主動脈放于培養皿，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗數次。眼科剪縱行剖開血管，眼科彎鑷自上而下輕刮內膜2～3遍去除單層的內皮細胞，鑷子剝離外膜。更換培養皿，加入少量20%FBS的DMEM培養液，眼科剪反復剪碎血管中膜組織成11 mm2×1 mm2大?。羟?0 min左右）。用彎頭吸管將血管組織小塊移入一次性塑料培養瓶內，均勻種植于培養瓶底，蓋好瓶蓋，平躺放入培養箱內。3～4 h后加入3～5 mL含20%FBS的DMEM培養基，使植塊剛好浸入培養液中。培養箱內靜置培養3 d后，換新鮮培養液，以后根據具體情況更換培養基，初期盡量少動，以免影響細胞貼壁和生長。待植塊周圍生長暈的細胞融合成片時，即可傳代。相差顯微鏡觀察細胞生長形態，采用第2代細胞行α-actin單克隆抗體進行免疫細胞化學染色鑒定，取第3～5代VSMCs。

1．3 實驗分組 對照組：1%FBS的DMEM；AngⅡ組：AngⅡ（10-6mol／L）；Val1＋AngⅡ組：Val（10-3mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；Val2＋AngⅡ組：Val（10-4mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；Val3＋AngⅡ組：Val（10-5mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；PD＋AngⅡ組：PD98059（10-5mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；SB＋AngⅡ組：SB23015（10-5mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；Val組：Val（10-3mol／L）。

1．4 MTT法檢測細胞增殖 取3～5代對數生長期的細胞，消化、離心，10%FBS的DMEM培養液稀釋細胞成5×104／mL的密度，接種于96孔板，200μL／孔，培養24 h。換用0．5%FBS的DMEM培養液，200μL／孔，培養24 h，使細胞同步于靜止生長期（G0／G1期）。換用1%FBS的DMEM培養液，200 μL／孔，并進行藥物干預，Val1＋AngⅡ組、Val2＋AngⅡ組、Val3＋AngⅡ組、Val組提前加入Val干預30 min，PD＋AngⅡ組、SB＋AngⅡ組提前分別加入PD98059，SB23015干預30 min，繼續培養24 h。MTT分析檢測：細胞培養20 h時每孔加入MTT（5 mg／mL）20μL，繼續培養4 h，吸凈培養液，每孔加入二甲基亞砜150μL，微量振蕩器振蕩約10 min，酶標儀檢測吸光度OD值。

1．5 細胞劃痕試驗測定VSMCs遷移距離 選擇第3～5代生長良好的VSMCs，胰蛋白酶制備細胞懸液，調整細胞密度為1．0×105／mL，均勻接種于6孔板中。在鋪板前，在板的背面用記號筆劃5～6道平行的橫線。待細胞貼壁生長至70%～80%匯合時，吸棄原含10%血清的培養液，換用含0．5%血清的DMEM培養液繼續培養24 h，使VSMCs同步化，處于G0／G1期。用無菌的200μL槍頭劃痕移液管尖（約0．7 mm）在各培養板細胞生長單層相同位置劃垂直或平行直線，與以上的橫線要垂直，造成幾條“傷口”。PBS洗2次，去除被移液管尖破壞而脫落的細胞，加1%FBS的DMEM培養液。根據實驗分組先分別加入Val（10-3mol／L）、Val（10-4mol／L）、Val（10-5mol／L）、PD98059（10-5mol／L）、SB23015（10-5mol／L）與細胞孵育1 h，然后再加入AngⅡ繼續作用。倒置顯微鏡下觀察細胞遷移。于24 h時觀察各組細胞遷移情況，超過劃線的細胞最遠距離，即實際遷移距離。照相，測距離3次，計算均值。

1．6 Val、PD98059、SB23015、AngⅡ對VSMCs ERK1／2、p-ERK1／2、P38、p-P38蛋白表達的影響 選擇第3～5代生長良好的VSMCs，待細胞貼壁生長至60%～70%匯合時，換用含0．5%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養24 h，使VSMCs同步化，處于G0／G1期。換用1%FBS的DMEM培養液5 mL／瓶，各實驗組加入相應藥物干預，對照組不處理，放入培養箱中繼續培養，在30 min結束培養。每瓶加入裂解液與酶抑制劑的混合液300μL，細胞刮刀刮下瓶底的細胞，迅速移入1．5 mL EP管中。離心12 000 r／min，4℃，20 min。吸取上清液，于-20℃冰箱中短期保存。按BCA蛋白測定試劑盒說明書檢測蛋白濃度。按常規方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），2．5 mA／c m2，50 min轉膜（NC膜），取出NC膜，加入5%脫脂奶粉封閉液中置搖床輕輕搖動封閉3 h，置 于ERK1／2、p-ERK1／2、P38、p-P38一 抗 工 作 液（1∶1 000），室溫下振搖2 h，4℃冰箱過夜，洗滌緩沖液清洗5 min×3遍，加入山羊抗兔二抗工作液（1∶1 000），室溫下振搖2 h，用洗滌緩沖液清洗5 min×3遍，雙蒸餾水洗5 min。10 mL AP底物緩沖液中先后加入66 L氯化硝基四氮唑藍和33 L-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（現配現用），將清洗好的NC膜放入AP顯色液中，搖床上邊搖邊觀察顯色情況，可見棕黑色的條帶。取出NC膜，避光晾干，將條帶掃描入電腦，采用Image J軟件分析灰度值。

1．7 統計學處理 采用SPSS17．0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0．05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 VSMCs的鑒定 VSMCs鑒定：細胞質內呈棕黃色絲狀條紋者為陽性。隨機挑取5個以上高倍視野，計數100個細胞中陽性細胞占95%以上方可用于實驗。

2．2 Val、PD98059和SB23015對AngⅡ促進VSMCs增殖的影響 與對照組相比，AngⅡ能明顯促進VSMCs的增殖（P＜0．01）；Val在濃度為10-5～10-3mol／L時，呈濃度依賴性抑制VSMCs對AngⅡ的增殖（P＜0．01）。PD98059能抑制AngⅡ的促VSMCs增殖作用（P＜0．01）；而SB23015能明顯促進AngⅡ的促VSMCs增殖作用（P＜0．01）。同時，與對照組相比，Val單獨作用于VSMCs時，對細胞增殖的影響，差異無統計學意義（P＞0．05）。表見1。

表1 Val、PD98059和SE23015干預后的MTT 結果±s，n＝6）

表1 Val、PD98059和SE23015干預后的MTT 結果±s，n＝6）

組別 24 h OD值對照組 0．379±0．033 a AngⅡ組0．598±0．051

續表1 Val、PD98059和SE23015干預后的MTT 結果（±s，n＝6）

續表1 Val、PD98059和SE23015干預后的MTT 結果（±s，n＝6）

a：P＜0．01，與AngⅡ組比較；b：P＜0．01，與Val 1＋AngⅡ組比較；c：P＜0．05，與AngⅡ組比較。

組別 24 h OD值Val 1＋AngⅡ組 0．422±0．043 a Val 2＋AngⅡ組 0．494±0．049 ab Val 3＋AngⅡ組 0．540±0．029 bc PD＋AngⅡ組 0．514±0．045 a SB＋AngⅡ組 0．649±0．026 c Val組 0．377±0．027 a

2．3 Val和PD98059對AngⅡ促進VSMCs遷移的影響 VSMCs經AngⅡ作用后，遷移活性明顯增加，AngⅡ作用于細胞24 h，VSMCs遷移活性是對照組的1．29倍（P＜0．01）；Val及PD98059抑制AngⅡ誘導大鼠VSMCs的遷移（P＜0．05），但SB23015作用與之相反（P＜0．05）。同時，與對照組相比，Val單獨作用于VSMCs時，對細胞遷移的影響，差異無統計學意義（P＞0．05）。見表2。

表2 Val、PD98059和SE23015干預后的VSMCs 遷移距離（±s，n＝3）

表2 Val、PD98059和SE23015干預后的VSMCs 遷移距離（±s，n＝3）

a：P＜0．01，與AngⅡ組比較；b：P＜0．05，與AngⅡ組比較；c：P＜0．05，與Val 1＋AngⅡ組比較。

組別 24 h細胞遷移距離（μm）對照組 168．0±8．5 a AngⅡ組 217．7±12．5 Val 1＋AngⅡ組 173．0±11．5 a Val 2＋AngⅡ組 185．7±9．5 a Val 3＋AngⅡ組 195．3±11．4 bc PD＋AngⅡ組 189．0±10．4 b SB＋AngⅡ組 241．7±13．4 b Val組 162．0±12．0 a

2．4 Val、PD98059、SB23015對AngⅡ促進VSMCs胞內p-ERK1／2、p-P38表達的影響 與對照組相比，AngⅡ能促進VSMCs胞內p-ERK1／2、p-P38的表達，Val能抑制AngⅡ的促VSMCs胞 內p-ERK1／2、p-P38表 達 的 作 用（P＜0．01）；PD98059能抑制AngⅡ的促VSMCs胞內p-ERK1／2表達的作用（P＜0．01）；但對AngⅡ促進VSMCs胞內p-P38的表達的影響，差異無統計學意義（P＞0．05）；SB23015能促進AngⅡ的促VSMCs胞內p-ERK1／2表達的作用（P＜0．05）。同時，與對照組相比，Val單獨作用于VSMCs時，對胞內p-ERK1／2、p-P38表達的影響，差異無統計學意義（P＞0．05），見表3、圖1。

表3 Val、PD98059和SE23015干預后的p-ERK1／2、 p-P38的表達（±s，n＝3）

表3 Val、PD98059和SE23015干預后的p-ERK1／2、 p-P38的表達（±s，n＝3）

組別灰度值p-ERK1／2 p -P38對照組 1．00±0．00a 1．00±0．00 a

續表3 Val、PD98059和SE23015干預后的p-ERK1／2、 p-P38的表達（±s，n＝3）

續表3 Val、PD98059和SE23015干預后的p-ERK1／2、 p-P38的表達（±s，n＝3）

a：P＜0．01，與AngⅡ組比較；b：P＜0．05，與Val 1＋AngⅡ組比較；c：P＜0．05，與AngⅡ組比較；d：P＜0．01，與Val 1＋AngⅡ組比較。

組別灰度值p-ERK1／2 p-P38 AngⅡ組2．11±0．09 2．84±0．13 Val 1＋AngⅡ組 1．32±0．07 a 1．46±0．13 a Val 2＋AngⅡ組 1．38±0．06 a 1．63±0．11 a Val 3＋AngⅡ組 1．45±0．06 ab 1．80±0．07 ad PD＋AngⅡ組 1．40±0．07a 2．81±0．12 SB＋AngⅡ組 2．27±0．12 c 1．96±．11 a Val組 1．02±0．08 a 1．06±0．11 a

圖1 不同干預組作用后ERK1／2、P38蛋白印跡條帶

3 討 論

AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的重要產物，AT1R、AT2R是AngⅡ的2個特異性受體，在細胞生長和增殖方面顯示出相反的效果［4-9］。研究發現，AT1R的激活增加了再狹窄過程中的各種損傷反應［10-13］。AngⅡ拮抗劑Val在預防支架術后再狹窄方面是可行的。2007年，Iwata等［6］進行了Val與氯沙坦預防支架術后再狹窄的比較研究，發現支架術后治療6個月，生理劑量的Val可明顯降低支架血管的再血管化率，且Val組冠狀動脈造影顯示的靶血管管腔縮小的程度明顯低于氯沙坦組。2005年，Peters等［7］進行的臨床試驗，發現支架術后治療6個月，Val組的再狹窄率低于血管緊張素轉換酶抑制劑組（P＜0．05）。

本實驗應用MTT分析法評估了VSMCs的增殖狀況，在AngⅡ（10-6mol／L）的刺激下，Val（10-5～10-3mol／L）呈濃度依賴性抑制VSMCs的增殖，與AngⅡ組相比差異有統計學意義（P＜0．05）。而Val單獨作用于VSMCs時，與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0．05），表明Val能明顯拮抗AngⅡ的促增殖作用。另外，作者發現AngⅡ（10-6mol／L）能明顯刺激VSMCs的遷移，這一作用被Val（10-5～10-3mol／L）呈劑量依賴性地抑制，且差異具有統計學意義（P＜0．05）。而Val單獨作用時，對VSMCs的遷移無明顯影響，表明Val能明顯拮抗AngⅡ的促遷移作用。

AngⅡ激活AT1R后促進VSMCs的增殖、遷移與細胞外信號通路ERK1／2 MAPK的表達上調有關［8］。目前關于Val對AngⅡ誘導VSMCs的增殖與遷移的影響以及與p-ERK1／2、p-P38 MAPK表達關系的研究并不多。在本實驗應用MTT分析法和劃痕試驗評估了ERK1／2的特異性抑制劑PD98059（10-5mol／L）、P38特異性抑制劑SB23015（10-5mol／L）對AngⅡ誘導VSMCs的增殖與遷移的影響。實驗結果顯示，PD98059能顯著抑制AngⅡ誘導的VSMCs的增殖與遷移，而SB23015能顯著促進AngⅡ誘導的VSMCs的增殖與遷移，提示AngⅡ誘導的細胞增殖、遷移與磷酸化ERK1／2 MAPK表達上調有關，且磷酸化P38在此過程中起負性調節作用。實驗還應用蛋白質印跡法評估了Val、PD98059及SB23015對AngⅡ誘導的VSMCs內磷酸化ERK1／2、P38 MAPK表達上調的影響。作者選擇30 min作為觀察時間，Val（10-5～10-3mol／L）和SB23015（10-5mol／L）明顯抑制了AngⅡ誘導的磷酸化P38 MAPK的表達，PD98059（10-5mol／L）則對此過程無明顯影響，說明磷酸化ERK1／2 MAPK則對AngⅡ誘導的磷酸化P38 MAPK的表達無調節作用。這與Kintscher等［9］研究結果相一致。

綜上所述，Val預防支架術后再狹窄的機制可能與其抑制AngⅡ誘導的VSMCs的增殖與遷移及ERK1／2 MAPK表達有關，而磷酸化P38 MAPK則對AngⅡ誘導的磷酸化ERK1／2 MAPK的表達起負性調節作用。這為今后臨床應用Val預防支架植入術后再狹窄提供了依據。

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