人食管癌裸鼠皮下移植及原位移植模型的建立＊

姚文健，白 玉，趙寶生△

（1．新鄉醫學院第一附屬醫院胸外科，河南新鄉453100；2．新鄉醫學院病理學教研室，河南新鄉453003）

腫瘤是當前威脅人類生命最嚴重的疾病之一，每年死于腫瘤的人數以百萬計，腫瘤的防治研究，已成為醫學研究中的重要課題。在動物體內建立人類疾病模型可以更好地模擬活體狀態下疾病的特征，為疾病病因研究及治療提供實驗材料。1969年Ryaaid首次成功地將人類腫瘤移植于無胸腺裸小鼠，這為異種動物腫瘤移植開辟了新局面。由于裸鼠缺乏T淋巴細胞功能，所以是極為理想的腫瘤移植模型材料［1］。我國在這方面已經做了不少探索，成功地將大腸癌［2］、乳腺癌［3］、肺癌［4］等移植于裸鼠。但關于食管癌裸鼠皮下移植尤其是原位移植模型的報道較少，本實驗采用將人食管癌組織塊接種于裸鼠體內的方法，觀察其生長特征，初步建立了人食管癌裸鼠皮下移植及原位移植模型，為食管癌的研究提供了重要的實驗工具。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 食管癌組織來源 食管癌組織來源于新鄉醫學院第一附屬醫院胸外科的1例食管癌患者手術切除標本，病理診斷為低分化、淋巴結轉移陽性食管鱗癌組織，且術前未進行放化療。

1．1．2 實驗動物 實驗所用的BALB／C裸鼠由新鄉醫學院動物實驗中心提供，3～4周齡，體質量16～22 g，雌雄均可，隨機取用。裸鼠在恒溫（25～27℃）、恒濕（40%～50%）、無特殊病原菌級飼養室條件下飼養。動物先放于有機玻璃盒內，再置于超凈生物層流架內，每個飼養盒內飼養5～6只裸鼠。籠具、墊料、飼料、飲水均經高壓蒸汽滅菌。所有實驗程序均嚴格按無菌操作規程進行。

1．2 方法

1．2．1 腫瘤手術標本的移植 手術切除標本離體后在無菌條件下去除包膜，清除標本周圍的纖維組織及壞死部分，用含有青霉素／鏈霉素雙抗（終濃度為100 IU／mL）及10%胎牛血清的RPMI-1640培養液反復沖洗后，取新鮮的癌組織用彎剪剪成約1 mm3組織碎塊。裸鼠經0．5%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射全身麻醉。取2粒組織碎塊包埋于裸鼠右腹部皮下，共10例，5／0絲線縫皮，繼續飼養觀察，取原代移植成功且腫瘤生長良好的裸鼠1只，處死后進行鼠間傳代，連續傳代3次，每代10只，觀察成瘤率。

1．2．2 裸鼠皮下移植 取10例裸鼠，全身麻醉后取傳3代后移植瘤移植于裸鼠皮下，移植方法同上。術后繼續飼養，每周觀察2次。裸鼠飼養至自然死亡或瀕臨死亡狀態下處死。觀察移植瘤成瘤率、大體及組織形態、腫瘤的侵襲和轉移情況。

1．2．3 裸鼠食管黏膜下移植 取10例裸鼠，全身麻醉后取腹正中線切口開腹，在手術顯微鏡下游離食管下段。做3 mm切口深達黏膜下層，經切口將2粒1 mm3傳代后瘤塊以10／0無損傷縫合線固定于食管壁黏膜下層。以7／0絲線縫合腹膜，5／0絲線縫皮。荷瘤裸鼠飼養至自然死亡或瀕死狀態下處死，觀察移植瘤成瘤率、大體及組織形態、腫瘤的侵襲和轉移情況。

1．2．4 病理學檢測 上述移植瘤標本常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察。

2 結 果

2．1 裸鼠移植瘤成瘤率 人食管癌組織移植于10只裸鼠皮下，原代成瘤1只，成瘤率10%（1／10），傳代3次后，成瘤5只，成瘤率50%（5／10）。

2．2 裸鼠皮下移植模型的觀察 皮下移植的10例裸鼠共有6只形成肉眼可見腫瘤，成瘤率60%，移植瘤呈膨脹性生長，圓形或橢圓形，灰白色，邊界清楚，有纖維包膜包裹。光鏡下觀察移植瘤與人原發食管癌組織形態特點基本相同，為低分化鱗狀細胞癌。細胞呈片狀或條索狀排列，細胞大小不同、形態各異，核漿比增加，核分裂像多見，見圖1 A。腫瘤周圍淋巴結、肝、肺未見癌轉移。

2．3 裸鼠原位移植模型的觀察 食管黏膜下移植的10例裸鼠尸檢可見8例成瘤，成瘤率80%。原位腫瘤肉眼觀見圖1B。光鏡下觀察移植瘤與人原發食管癌組織形態特點基本相同，鏡下觀見圖1C。8例均發生食管周圍淋巴結癌轉移，轉移率100．0%（8／8），見圖1D；有3例發生肝轉移，轉移率37．5%（3／8）見圖1E；有2例發生肺轉移，轉移率25．0%（2／8），見圖1F。

圖1 病理學檢測結果

3 討 論

腫瘤動物模型是研究腫瘤生物學行為及腫瘤治療的主要工具之一，廣泛應用于腫瘤生長、腫瘤免疫、抗腫瘤藥物篩選等方面的研究［5］。應用裸鼠建立的移植性腫瘤模型是目前應用最多的動物模型，他是將外源性腫瘤細胞或組織移植到裸鼠內生長并形成腫瘤，其中以皮下移植模型和原位移植模型最為常見。

本研究采用瘤組織塊接種法，這種方法能較好地保持腫瘤細胞形態，接種后成瘤率高。在裸鼠皮下傳代3次的目的是通過反復傳代可以對腫瘤細胞起到篩選作用，提高成瘤率。與直接移植患者腫瘤標本相比，經過傳代后，移植瘤處于無菌狀態，用傳代后的移植瘤建模，瘤體更易存活，也有較高的成瘤率［6］。本次研究也證實了這一點。

傳統的移植途徑是將腫瘤細胞或組織進行皮下移植。皮下移植模型具有操作簡單、便于觀察的優點，可以部分模擬人惡性腫瘤的生物學特征，但皮下移植屬于異位移植，脫離了起源組織器官的微環境，在實驗中移植瘤的一些行為常不同于原先患者身上惡性腫瘤的生物學行為［7］。本次研究發現，皮下移植瘤雖與人原發食管癌組織相同，都是低分化鱗狀細胞癌，但移植瘤被纖維結締組織囊包繞，呈局限性生長，未見局部擴散和遠處器官轉移，原因考慮是結締組織包繞干擾了新生血管的生長和長入［8］。故皮下移植模型難以用于腫瘤轉移相關的研究。

原位移植，是將人類腫瘤細胞或組織移植到免疫缺陷動物相當于人類腫瘤原發部位組織器官內。與皮下移植相比，原位移植具有豐富的自然血管，可保證瘤體獲得充分的營養，且腫瘤細胞具有親器官性，容易在與母體腫瘤相同的器官上滯留、浸潤或擴散，更能模擬食管癌侵襲、轉移的特征［9］。本次研究發現，食管黏膜下移植瘤的成瘤率要高于皮下移植，為低分化鱗狀細胞癌，沒有包膜，呈浸潤性生長，可見廣泛淋巴結轉移及肝肺轉移。可見，原位移植為人類惡性腫瘤的研究，尤其是與侵襲、轉移相關的研究提供了更為適宜的動物模型。

［1］Povlsen CO，Rygaard J．Heterotransplantation of human epidermoid carcinomas to the mouse mutant nude［J］．Ac-ta Pathol Microbiol Scand A，1972，8（6）：713-717．

［2］張東興，顏登國，趙丙波．人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立［J］．貴陽醫學院學報，2010，35（3）：247-250，254．

［3］饒子亮，黃威，鄭佳琳，等．兩種人乳腺癌裸鼠移植模型的建立［J］．中國比較醫學雜志，2012，22（5）：5-8．

［4］王曉東，孫大強，李志，等．個體化裸鼠荷人肺癌腫瘤模型的建立［J］．天津醫藥，2012，40（5）：499-501．

［5］周杰，漆松濤，潘軍，等．人顱咽管瘤裸鼠皮下移植瘤模型的初步建立［J］．重慶醫學，2012，41（5）：455-457．

［6］Furukawa T，Fu X，Kubota T，et al．Nude mouse metastatic models of human stomach Cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intact tissue［J］．Cancer Res，1993，53（5）：1204-1208．

［7］楊宏宇，李金榮，胡傳真．人舌鱗癌裸鼠原位移植模型及其主要生物學特性的研究［J］．中華口腔醫學雜志，1998，33（2）：73．

［8］王輝，吳潔，花寶金，等．人胃癌免疫缺陷小鼠移植瘤轉移模型研究進展［J］．北京中醫藥，2012，31（3）：237-240．

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