原發(fā)性三叉神經(jīng)痛基因治療的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

秦泗佳 王福 張奎啟 高璐 金海威

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛有臨床癥狀但無(wú)與發(fā)病有關(guān)的器質(zhì)性或功能性病變，陣發(fā)性劇痛是其疼痛特點(diǎn)，且疼痛的程度隨病程的延長(zhǎng)而加重，疼痛發(fā)作的頻率也會(huì)逐漸增加。原發(fā)性三叉神經(jīng)痛發(fā)病率約8/10萬(wàn)，平均發(fā)病年齡(62.7±15.8)歲，據(jù)臨床癥狀可將其分為典型和不典型[1]。隨著社會(huì)生活水平的提高，人的壽命不斷延長(zhǎng)，高齡人群不斷增多，該病的發(fā)病率也逐漸增高[1]。因其病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，所以尚無(wú)成熟可靠的治療方法。主要的治療方法有藥物、手術(shù)、放射、中醫(yī)、基因和其他療法等，每種方法各有利弊。近年來(lái)采用基因手段治療三叉神經(jīng)痛成為研究的熱點(diǎn)，本文著重從基因治療方面對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究作一綜述。

一、基因治療疼痛的原理及技術(shù)

1.基因治療疼痛的原理

基因治療疼痛是通過(guò)上調(diào)抗痛基因或下調(diào)疼痛基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。前者通過(guò)基因重組技術(shù)將抗痛基因、調(diào)控因子基因和疼痛相關(guān)受體基因插入到轉(zhuǎn)運(yùn)載體，再將重組的載體導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，作用于初級(jí)傳入神經(jīng)和脊髓背角；后者利用反義寡核苷酸下調(diào)神經(jīng)內(nèi)源性疼痛基因的表達(dá)或下調(diào)疼痛作用位點(diǎn)：蛋白激酶C、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體和神經(jīng)調(diào)節(jié)素1受體等。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)痛發(fā)作時(shí)，相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生會(huì)出現(xiàn)變化，提示可通過(guò)相關(guān)載體介導(dǎo)產(chǎn)生這些神經(jīng)遞質(zhì)的基因靶向?qū)氚薪M織，通過(guò)改變相關(guān)遞質(zhì)的水平達(dá)到鎮(zhèn)痛目的。

2.基因治療疼痛的技術(shù)

主要的技術(shù)手段有基因的修復(fù)、置換、失活、修飾和免疫調(diào)節(jié)等。基因修復(fù)是指依照正常的基因結(jié)構(gòu)修復(fù)異常的基因使其恢復(fù)正常的基因結(jié)構(gòu)；將正常的基因?qū)氲酵蛔兊募?xì)胞內(nèi)替換掉病變的基因稱為基因置換；利用反義寡核苷酸技術(shù)和RNA干擾(RNAi)技術(shù)有針對(duì)性地封閉病變的基因稱為基因失活；利用各種技術(shù)將所需的目的基因?qū)氲讲∽兊募?xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)以改善或彌補(bǔ)病變細(xì)胞的相關(guān)功能稱為基因修飾；將目的基因?qū)氲交颊叩捏w內(nèi)，以改變患者的免疫功能稱為免疫調(diào)節(jié)。

二、基因治療疼痛的主要內(nèi)容

基因治療疼痛主要包括：鎮(zhèn)痛基因的選擇；鎮(zhèn)痛基因的擴(kuò)增、測(cè)序；鎮(zhèn)痛基因轉(zhuǎn)移載體；鎮(zhèn)痛基因靶組織的選擇；鎮(zhèn)痛基因表達(dá)的調(diào)控；試驗(yàn)療效及安全性評(píng)價(jià)等。目前的研究多集中在鎮(zhèn)痛基因的選擇、鎮(zhèn)痛基因轉(zhuǎn)移載體和鎮(zhèn)痛基因表達(dá)的調(diào)控等方面，故還需要加強(qiáng)對(duì)其它方面的研究。

1.鎮(zhèn)痛基因

鎮(zhèn)痛基因主要有阿片肽類、細(xì)胞因子類和RNAi。

阿片肽類主要包括腦啡肽、β-內(nèi)啡肽、孤啡肽、內(nèi)嗎啡肽和強(qiáng)啡肽5種，其作用機(jī)制是通過(guò)與體內(nèi)的阿片類受體相結(jié)合抑制疼痛信息的傳遞[1]。①1975年腦啡肽在豬腦中被發(fā)現(xiàn)，主要包括甲硫氨酸腦啡肽和亮啡肽兩種，它對(duì)δ受體有較強(qiáng)的選擇性，多種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可經(jīng)其介導(dǎo)的阿片受體作用產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果。在大鼠鞘內(nèi)注入含有人前腦啡肽原基因的單純皰疹病毒Ⅰ型擴(kuò)增子載體可轉(zhuǎn)染大鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞，并在該細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)重組的腦啡肽基因，產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果。以慢病毒作為載體也同樣有良好的鎮(zhèn)痛效果。②β-內(nèi)啡肽的鎮(zhèn)痛效果要比腦啡肽強(qiáng)，能直接與脊髓的μ受體和ε受體結(jié)合，使腦啡肽的分泌增多從而產(chǎn)生更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果。在大鼠鞘內(nèi)注入含有人β-內(nèi)啡肽基因的重組腺病毒后，大鼠腦脊液內(nèi)β-內(nèi)啡肽濃度明顯增高。③孤啡肽的氨基酸序列與強(qiáng)啡肽相似，它的受體是一種孤兒受體，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。在腦室內(nèi)注入微量的腦啡肽就能使大鼠的痛閾降低，還可抑制嗎啡的抗傷害鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但其作為目的基因還需要大量的基礎(chǔ)研究結(jié)果支持。④內(nèi)嗎啡肽對(duì)μ受體有高度的選擇性，其親和力強(qiáng)，主要分布在腦和脊髓。將內(nèi)嗎啡肽注入到腦和脊髓的蛛網(wǎng)膜下隙可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果，其對(duì)于炎性疼痛和神經(jīng)痛有明顯的鎮(zhèn)痛效果，最適宜用于頑固性疼痛的治療，但目前的研究均只采用直接注射的方法，此法易產(chǎn)生耐受。⑤腦和脊髓的神經(jīng)元中均能分泌強(qiáng)啡肽，其在脊髓的作用復(fù)雜，正常水平時(shí)就能起到鎮(zhèn)痛的效果，在神經(jīng)受損后，腦脊液中的水平明顯升高。因其在脊髓痛覺(jué)調(diào)控中具有雙重調(diào)控作用，所以目前還沒(méi)有將其應(yīng)用于疼痛基因治療的研究。

細(xì)胞因子類主要包括免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子兩大類。①免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子主要以抑制神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)或類阿片肽的作用來(lái)治療疼痛，主要包括IL-2和IL-10。將含有能表達(dá)人源IL-2的重組腺病毒注入大鼠腦脊液內(nèi)，在大鼠的軟脊膜和各段脊髓實(shí)質(zhì)中能檢測(cè)到人源IL-2 mRNA的表達(dá)，說(shuō)明注射能表達(dá)人源IL-2的重組腺病毒對(duì)慢性神經(jīng)病理性疼痛具有明顯的鎮(zhèn)痛效果。將含人IL-10基因的慢病毒載體經(jīng)鞘內(nèi)注射后，坐骨神經(jīng)慢性壓迫(CCI)模型大鼠痛覺(jué)異常明顯緩解，其脊髓、腦皮質(zhì)和海馬中的IL-10表達(dá)上調(diào)。②神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以促進(jìn)特定神經(jīng)組織細(xì)胞的分化與再生，還可刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和改變神經(jīng)元特性。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子主要包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3和神經(jīng)生長(zhǎng)因子等，多用于神經(jīng)損傷或中毒導(dǎo)致的慢性神經(jīng)痛。黃愛(ài)蘋等[2]將慢病毒載體介導(dǎo)的BDNF基因與電針對(duì)神經(jīng)病理痛模型大鼠痛閾的影響進(jìn)行比較，認(rèn)為BDNF 參與了大鼠痛敏的過(guò)程，BDNF的表達(dá)有利于受損神經(jīng)修復(fù)。

RNAi是利用一種小片段干擾性雙鏈RNA作為效應(yīng)分子，催化與靶基因mRNA結(jié)合的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而減少mRNA的含量。RNAi主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)正義鏈的聚合酶鏈反應(yīng)大量擴(kuò)增干擾性RNA來(lái)干擾目的基因的表達(dá)。RNAi在植物及非脊椎動(dòng)物的應(yīng)用中已有較多的研究報(bào)道，但在哺乳動(dòng)物中尚未見(jiàn)成功的報(bào)道。

2.基因轉(zhuǎn)移載體

基因轉(zhuǎn)移載體主要有病毒載體和非病毒載體。

病毒載體主要利用病毒包膜蛋白的識(shí)別作用將外源基因轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞內(nèi)，主要包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體、單純皰疹病毒(HSV)載體和慢病毒載體，相關(guān)病毒載體的比較可參見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。病毒載體的主要缺點(diǎn)是存在自身免疫原性和可能造成細(xì)胞的病理改變等。①腺病毒(AV)載體與單鏈逆轉(zhuǎn)錄DNA病毒載體能高效地感染分裂和非分裂細(xì)胞。腺病毒載體能夠介導(dǎo)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLT-1)、谷氨酸脫羧酶(GAD)、鉀離子通道Kir2.1、β-內(nèi)啡肽、IL-2、IL-10和IL-24等，該載體經(jīng)鞘內(nèi)注射后主要感染腦膜細(xì)胞，這說(shuō)明該載體可有其他的特異性靶細(xì)胞[4]。②腺病毒載體經(jīng)修飾后即為AAV，它的免疫原性比腺病毒低，不導(dǎo)致炎癥的發(fā)生或產(chǎn)生抗體。AAV有多種血清型，不同血清型的趨向性與注射的途徑有關(guān)，鞘內(nèi)注射能感染60%的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元，皮內(nèi)注射時(shí)感染率遠(yuǎn)低于30%[5]。2009年Towne等報(bào)道將以AAV為載體且能表達(dá)針對(duì)電壓依賴性鈉離子通道Na(v)1.3的小發(fā)卡RNA的病毒注射入DRG可減輕保留神經(jīng)損傷(SNI)模型誘導(dǎo)的病理性疼痛。③HSV有兩條DNA鏈，有嗜神經(jīng)性，感染感覺(jué)神經(jīng)末梢后能逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)元胞體，從而減少給藥的次數(shù)和不良反應(yīng)，應(yīng)用前景良好[6]。HSV載體可介導(dǎo)腦啡肽原、γ-氨基丁酸、氨基脫羧酶和TNF-α，其中TNF-α是一種炎性因子，在神經(jīng)病理性疼痛調(diào)控中起重要作用。用HSV介導(dǎo)TNF-α能減輕大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎神經(jīng)病理性疼痛引起的疼痛行為。目前表達(dá)人的前腦啡肽原的HSV載體已應(yīng)用于臨床Ⅰ期試驗(yàn)，將其接種在皮下可減輕癌癥引起的疼痛[7]。④慢病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是能容納大片段的基因且免疫反應(yīng)小，而且能感染非分裂期的細(xì)胞。通過(guò)構(gòu)建攜帶含下游調(diào)控元件的拮抗分子(DREAM)基因短發(fā)夾干擾RNA的慢病毒載體，然后注入到坐骨神經(jīng)縮窄損傷的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)慢病毒攜帶的短發(fā)夾干擾RNA能干擾脊髓中DREAM的表達(dá), 說(shuō)明此法可用于神經(jīng)病理性疼痛的治療。

非病毒載體因其諸多優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注。非病毒載體主要有細(xì)胞載體、脂質(zhì)體和質(zhì)粒等。①細(xì)胞載體具有取材和培養(yǎng)簡(jiǎn)便、易轉(zhuǎn)染、高表達(dá)且無(wú)排斥等優(yōu)點(diǎn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示有較好的鎮(zhèn)痛效果[8]。早期多使用腫瘤細(xì)胞，現(xiàn)在多使用神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞等。因宿主抗外源細(xì)胞免疫反應(yīng)，所以可采用生物材料將細(xì)胞微囊化，以降低免疫反應(yīng)的程度。②脂質(zhì)體主要包括中性、陰離子和陽(yáng)離子脂質(zhì)體，因中性和陰離子脂質(zhì)體自身帶有很大的缺點(diǎn)，所以應(yīng)用受限。陽(yáng)離子脂質(zhì)體自身帶有正電荷能夠與帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜進(jìn)行融合，從而利用胞吞作用形成內(nèi)涵體的形式介導(dǎo)DNA進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。由于帶有正電荷，在血液循環(huán)中能與帶負(fù)電荷的血清蛋白吸附，形成聚集體而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，造成其血液循環(huán)時(shí)間短、轉(zhuǎn)染率低。針對(duì)此缺點(diǎn)，現(xiàn)已研發(fā)了基于可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體，稱為穩(wěn)定的核酸-脂質(zhì)粒子[9]。該粒子在血液中易與載脂蛋白結(jié)合，易被肝細(xì)胞吸收，具有很好的肝靶向[10]。Yu等[11]則合成了不同親水頭和疏水尾的可離子化陽(yáng)離子脂質(zhì)用于小干擾RNA的傳遞，效果顯著。Tabernero等[12]的研究發(fā)現(xiàn)核酸-脂質(zhì)粒子能很好地抑制肝腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。③質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且易制備，無(wú)免疫反應(yīng)，也是一種常用的非病毒載體。

3.基因轉(zhuǎn)染的靶向性

基因轉(zhuǎn)染主要以神經(jīng)元和神經(jīng)元周邊的腦膜細(xì)胞為靶細(xì)胞。通過(guò)外周皮膚或黏膜注射及神經(jīng)核團(tuán)定點(diǎn)注射的靶細(xì)胞為神經(jīng)元；通過(guò)腦脊液內(nèi)注射的靶細(xì)胞為神經(jīng)元周邊的腦膜細(xì)胞。以抗痛基因的過(guò)表達(dá)為靶點(diǎn)主要有：阿片肽前體、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子等；以減少疼痛基因的表達(dá)為靶點(diǎn)主要有：蛋白激酶C、GTP環(huán)化水解酶1、NMDA受體和電壓依賴性鈉離子通道Na(v)1.3[6]。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在偏頭疼中樞敏感化過(guò)程中，蛋白激酶Cε膜轉(zhuǎn)位增加[13]。NMDA受體的2B亞基是參與疼痛調(diào)節(jié)的主要亞基，截肢前阻斷疼痛刺激能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)NMDA受體2B亞基的激活，阻止術(shù)后遷延性疼痛的發(fā)生[14]。

4.基因治療表達(dá)的調(diào)控

我們可以在不同水平調(diào)節(jié)基因治療，現(xiàn)有的研究多集中在動(dòng)物模型中，臨床應(yīng)用研究還較少，需行進(jìn)一步的探索研究。Wolfe等于2009年報(bào)道，他們?cè)谕晟频呐R床前期準(zhǔn)備后將HSV基因載體用于治療頑固性癌痛患者，觀察其臨床鎮(zhèn)痛效果和不良反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)阻礙其臨床應(yīng)用的問(wèn)題在于相關(guān)載體和基因產(chǎn)物的安全性，也應(yīng)注意如何提高其表達(dá)效率和血腦、血神經(jīng)屏障通過(guò)率。通過(guò)電針能增強(qiáng)慢性炎癥疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)牛腎上腺髓質(zhì)22肽的表達(dá)，并增強(qiáng)其非阿片受體(感覺(jué)神經(jīng)元特異性受體)和阿片受體(μ阿片受體、δ阿片受體)mRNA的表達(dá)[15]。

5.基因治療療效及安全性評(píng)價(jià)

療效的評(píng)價(jià)主要是在動(dòng)物模型上體現(xiàn)的，現(xiàn)有的建立三叉神經(jīng)痛動(dòng)物模型的方法主要有以下幾種：慢性縮窄環(huán)模型、三叉神經(jīng)末梢致痛模型、牙髓灌注模型、三叉神經(jīng)根埋植模型、經(jīng)顳下窩暴露三叉神經(jīng)節(jié)模型、經(jīng)枕骨下暴露三叉神經(jīng)根模型和經(jīng)顳下暴露三叉神經(jīng)節(jié)模型[16]。然后運(yùn)用感覺(jué)測(cè)試器在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察動(dòng)物模型的行為反應(yīng)和疼痛閾值的變化，以此來(lái)判斷基因治療的療效。

基因治療的安全性主要涉及到載體和基因產(chǎn)物兩方面。若為病毒載體往往具有一定的神經(jīng)毒性，AAV的毒性最小，而非病毒載體一般沒(méi)有毒性。基因的過(guò)度表達(dá)會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂，過(guò)少又往往達(dá)不到預(yù)期的治療目的，因此關(guān)鍵還在于調(diào)控機(jī)制是否得當(dāng)。

三、總結(jié)與展望

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制未明，雖有多種治療方法，仍不能達(dá)到理想效果，今后應(yīng)更深入地研究其機(jī)制，探索治療該病的更安全有效的療法，深入研究基因治療的可行性。治療應(yīng)采用個(gè)性化的治療方案，可結(jié)合多種療法。同時(shí)注重提高患者的生活質(zhì)量，加強(qiáng)患者的心理治療，消除抑郁、悲觀情緒，使其能更好地配合治療。隨著生物治療技術(shù)的發(fā)展，基因治療已成為藥物、手術(shù)、放射和中醫(yī)中藥治療之后的又一種治療手段，若有合適的載體和基因，在保證安全性的基礎(chǔ)上，基因治療將在原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的治療中發(fā)揮重要的作用。

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