富血小板纖維蛋白新生誘導骨的研究進展

肖 瓊,董 露(綜述),陳紅亮,孫 勇(審校)

富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)屬于新一代血小板濃聚物,富含大量血小板、白細胞和細胞因子,具有致密的三維網狀結構,可誘導多種細胞增殖和分化。目前實驗研究和臨床試驗揭示PRF有良好的應用前景,本文就PRF的發展歷程、制備方法、主要成分及立體結構、新生誘導骨形成的機制以及口腔種植中的應用等研究進展作一綜述。

1 PRF的發展歷程

20世紀80年代,許多學者開始對血液濃聚物進行深入研究,先后提出了具有代表性的富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)和PRF。1997年Whitman等[1]提出將PRP應用于頜面外科切除術后和口腔種植手術。雖然PRP可促進組織修復,但由于鈣離子和凝血酶的加入,可能引起潛在的疾病傳播和免疫原性危險。新一代血小板濃聚物PRF,制備過程簡單,并且不對血液作任何生化處理,是Choukroun于2000年在法國成功制取[2]。Choukroun通過回顧性研究得出,PRF在制備時緩慢聚合形成的纖維網接近生理狀態,更有效地促進細胞遷移、增殖和愈合,逐漸被運用于骨科、頜面外科和口腔種植等領域。

2 PRF的制備方法

PRF制備方法便捷:用10 ml無抗凝劑的試管,采集自體血液樣本,立即以3000 r/min(約400g的離心力)離心10 min,PRF獲得于試管中部。用專門的工具分離出PRF凝塊,無菌金屬勺子[3]壓制成膜。若同時需制備8～16塊PRF膜時,最好選用Dr.Joseph Choukroun 設計的PRF工具盒(Process,Nice)操作較便捷,并且壓力溫和、緩慢、均一,使PRF被滲出液浸濕保持相應的濕度,避免了抽拽導致的重要血小板生長因子,如血小板衍生因子AB(platelet-derived growth factor AB,PDGF-AB)丟失,但對血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和轉化生長因子β-1(transforming growth factor β-1,TGFβ-1)沒有影響[4]。制備可得到堅固稠密的自體纖維蛋白膜[1]或者柱形凝塊。臨床上獲取有效PRF凝塊的關鍵在于血液采集和離心速度；時間過長可能失敗:纖維蛋白將以發散的方式在試管里聚合,所得為低濃度的小部分血凝塊。PRF制備方法提出時,是以人為采集對象,推論于實驗動物就值得注意血管有無足夠的壓力和容量。Dohan等[5]對多個物種進行嚴格的PRF采集制備,發現兔子除致死率高的心內采血外,其余各個部位血管都不能實行均一和快速的采集,從而無法得到穩定的纖維蛋白聚合,大量紅細胞附和其中,應盡量避免選用。優先選擇大型動物,如比格犬、狒狒、豬或者更大的馬、山羊等。

3 PRF的主要成分和立體結構

3.1主要成分 PRF在離心過程中血小板被激活,在損傷區域聚合和凝血機制交互作用,成為啟動和幫助止血的基礎。脫顆粒作用下,重要的細胞因子被釋放:最有效力的纖維化劑TGFβ,影響PRF的空間結構,可作為炎癥調節劑[6]；遷移、增殖和間質細胞生存的重要的調節劑PDGF[7],根據特異性受體的分布誘導興奮這些細胞,該調節節點是各種組織改建機制的基礎[8]；細胞保護劑胰島素增長因子(insulin-like growth factors,IGF),積極地調節細胞增殖、分化和凋亡程序,誘導生存信號保護細胞[9]。上述3種主要的血小板細胞因子在初期愈合機制里尤為重要。

PRF同時含有大量白細胞[10],添加PRF可以減少損傷區域的有害反應如術后感染。PRF制備過程中,人為誘導增強了白細胞脫顆粒作用,分泌細胞因子參與應答止血和炎癥反應。主要包括促炎細胞因子:白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α),和抗炎細胞因子:IL-4和VEGF。有學者[11]研究發現它們嵌合在纖維蛋白網里并緩慢釋放,炎癥控制后,IL-4的存在作用值得進一步研究。PRF具有抗炎、免疫調節的作用,與促進血管新生的作用相輔相成。雖然PRF的特征已較清楚,但是對調節炎癥反應的機制尚未完全闡明。

3.2立體結構 嚴格按照制備標準得到的PRF,在試管里由下往上分為三部分:血紅細胞底層(red corpuscules base)、黃色柱狀工作網PRF、無細胞上層(serum platelet poor plasma,serum PPP)。Dohan等[12]研究表明,少量PDGF-BB、TGFβ-1和IGF-I在上層液和PRF血清里,說明PRF不同于其他血小板濃聚物,它能夠在纖維立體網狀結構的改建中逐漸釋放細胞因子；觀察到纖維蛋白的纖絲結構,聚糖鏈與纖維蛋白聚合,血小板陷入氨基聚糖(glycosaminoglycan,GAG)內,細胞因子大多存留在PRF網內。這種三維聚合模型標志細胞因子在纖維蛋白網里循環堅固的結合,延長了壽命。它們在原位可發揮修復作用；進入纖維愈合階段時,可促發損傷區域的重建,PRF精密的生物學組合在愈合階段有很好的協同效應。

4 PRF新生誘導骨形成的機制

PRF誘導各類型細胞如人牙齦的成纖維細胞、前角蛋白細胞、前脂肪細胞、成骨細胞等持續增殖興奮[12],其中白細胞類似一種伴侶分子大量增殖與之相互作用。誘導新骨的關鍵因素之一是間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),可聚集并分化軟骨細胞形成軟骨組織,再被骨組織所替代。骨膜內MSCs也可直接分化為成骨細胞形成骨組織。因此,種植體植入后,MSCs遷移至種植體的數量和在種植體表面增殖、黏附的速度將直接影響骨的重建和愈合。有研究證明PRP促進骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖,但是抑制分化。Dohan等[13]在體外對人的BMSCs進行培養,發現添加PRF膜可刺激其增殖,向成骨細胞分化,并且有明顯的劑量依賴性。國內學者[14]實驗也證實,PRF能夠促進兔的BMSCs在鈦板表面黏附和增殖。口腔MSCs和PRF的結合,可能提供很多臨床和生物技術應用,值得關注。但在以往研究中,白細胞并未得到重視,其相關作用及機制值得探索。

5 PRF新生誘導骨在口腔種植中的應用

國內外實驗研究證明,PRF有良好的骨誘導特性,在口腔種植領域具有優良的應用前景。Lee等[15]用自體骨聯合PRF作為移植材料,對犬上頜竇提升并同期種植,6個月平均骨種植體的結合率和新生骨平均高度均優于單獨自體骨移植。有學者將PRF作為屏障膜與海奧生物膜對比,修復兔下頜骨缺損,結果表明PRF能夠提高成骨質量,縮短成骨時間,但尚達不到屏障膜需要的充足降解時間,PRF膜與海奧生物膜聯合應用的雙層膜技術可進一步深入[16]。也有研究發現,PRF覆蓋骨粉與混合骨粉誘導骨再生效果無統計學差異[17]。徐普等[18]用PRF填塞犬拔牙即刻種植時周圍骨缺損,頰側骨量增加高度和成骨細胞數量明顯高于血凝塊、明膠海綿對照組,證明PRF利于種植體周圍骨缺損區新骨形成。

臨床試驗表明,PRF能促進骨組織再生。早期,PRF與骨移植材料通常聯合使用。在上頜竇提升手術中,Choukroun等[19]在竇底提升植骨時用同種異體凍干骨(freeze-dried bone allograft,FDBA)與PRF凝膠混合植入,二期種植時采集新生骨樣本做組織學分析,發現剩余骨被新生誘導骨包圍,并連接軟組織,提高了成骨速度和質量。Tatullo等[20]對60例上頜骨萎縮后高度<5 mm的患者,將PRF聯合BIO-OSS使用,愈合時間較以往文獻記載的150 d縮短為106 d。逐漸有PRF單獨使用的報道,Simonpieri等[21]用PRF單獨作為竇底植入材料,追蹤觀察2～6年,20例獲得8.5～12 mm的骨增量,新的竇底水平在種植體頂端,周圍骨量和骨高度堅固而穩定。國內學者[22]報道2例用PRF充填即刻種植間隙的骨缺損,3個月后牙槽嵴頂位置無顯著變化。在位點保存研究中,Hauser等[23]采用翻瓣和不翻瓣的拔牙術式后,充填PRF于拔牙創,分析骨微結構和骨質量,發現侵害性的外科程序會中和PRF的優點,最低限度的外傷性手術方式和PRF位點保存的共同應用,才可良好的保存硬組織。在牙周炎的治療中,Thorat等[24]對慢性牙周炎導致的牙槽骨缺損行翻瓣刮治后充填PRF對比觀察,發現PRF組的探診深度、附著水平及影像學參數明顯優于陰性對照組。

綜上所述,PRF富含白細胞、血小板和各種細胞因子,無免疫和感染方面的危害,便捷經濟的獲取方法,在口腔硬組織重建和骨再生領域中優勢明顯。但由于自體供血量有限,單獨使用時暫只能考慮修復小面積組織缺損,或者聯合其他生物材料共同修復。較多文獻報道PRF用于上頜竇提升和即刻種植周圍骨缺損時,取得良好療效,但對于單獨使用PRF作為誘導骨組織再生充填材料,并二期植入種植體的報道尚缺乏。關于PRF新生誘導骨組織近期組織學觀察較多,尚缺乏遠期生物力學方面研究。因此,PRF的廣泛應用,尤其在口腔種植這一學科,尚需深入的臨床觀察與實踐。

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